Форумы ANCHEM.RU: Пептидное картирование

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Пептидное картирование >>>

  Ответов в этой теме: 16
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Автор

Тема: Пептидное картирование

Яра
Пользователь
Ранг: 10

30.05.2007 // 16:18:02

Редактировано 1 раз(а)

Уважаемые коллеги!
Кто-нибудь может поделиться протоколом пептидного картирования? Нужен не столько режим хроматографирования (хотя, если не жалко...), сколько этап пробоподготовки: минимально необходимое количество белка, критические моменты буферных систем (в т.ч. для трипсинового гидролиза). Насколько необходимо введение высокомолекулярных составляющих (в моей прописи - полисорбат 20, если я правильно перевела)?

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

30.05.2007 // 16:47:46

Протокол (и количество белка) зависит от того что вы будете делать с гидролизатом: анализровать MALDI? LC-MS? LC с UV детекцией и собирать пики? варианты множатся и множатся.

Для трипсина в растворе и протокола не надо: сделайте 50 mM бикарбонат аммония, проверьте pH (0.5 мкл капните на инд бумажку), должно быть 7.5-9, сколько точно не важно и добавьте трипсин 1:5 (w/w). Поставьте на 37 на ночь и наутро будет вам счатье.

Да, если там дисульфидные связи есть то их надо восстановить 10 mM ДТТ или 5% меркаптоэтанолом (ДТТ лучше) при 55 С скажем, за час, а потом алкилировать иодуксусной кислотой или иодацетамидом (возьмите 2х избыток по молям) при комнатной температуре. Трипсину езбыток иодоацетамида не мешает.

В 90% случаев мочевиной и гуанидином можно не заморачиваться, и так трипсин все пожрет.

А полисорбат то вам там зачем?

Вообще, по сути одинаковых протоколов в сети миллион...

Яра
Пользователь
Ранг: 10

31.05.2007 // 10:06:07

Редактировано 2 раз(а)

Ну да, ну да. Я просто пытаюсь воспроизвести Британскую Фармакопею (ну нет ничего другого под рукой).
Написано там довольно бестолково, поэтому позвольте пару уточнений.

1. После трипсинолиза - LC с UV-детекцией. Цель - получить хроматограмму сравнения. Ориентировочно, количество белка 0.5-0.8 мг\мл. Нужно ли его еще концентрировать?

2. Насколько важен состав буфера для трипсина? Буржуи настаивают на прописи: трис-NaOAc-CaCl2 с полисорбатом. Соответственно, с предварительным обессоливанием и сменой буфера. Вот и мне интересно нафига? Белок и так идет в слабощелочном буфере.

3. Насколько полно идет гидролиз? Надо ли останавливать процесс чем-то типа фосфорной кислоты? И что такое 1:5? Раствор трипсина к раствору белка?

4. Насколько чувствителен трипсин к размеру пептидов? Если, например, идут подряд несколько глицилов, отдельные остатки трипсин выщепит? Стоит ожидать их пиков? Нужно калибровать колонку по отдельным аминокислотам (для трипсина, если я правильно помню, это глицин и аргинин)?

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

31.05.2007 // 13:41:10

1. После трипсинолиза - LC с UV-детекцией. Цель - получить хроматограмму сравнения. Ориентировочно, количество белка 0.5-0.8 мг\мл. Нужно ли его еще концентрировать?

Нет, если конечно, колонка не 4 мм. Но хроматограмма для сравнения вещь плохая по многим причинам (кратко, профиль зависит от всего)

2. Насколько важен состав буфера для трипсина? Буржуи настаивают на прописи: трис-NaOAc-CaCl2 с полисорбатом. Соответственно, с предварительным обессоливанием и сменой буфера. Вот и мне интересно нафига? Белок и так идет в слабощелочном буфере.

И мне интересно, нафига? Я бы еще понял мочевину или гуанидин для денатурации и/или детергент чтобы нерастворимый бело не падал и лучше переваривался. Если белок растворимый, и так покатит

3. Насколько полно идет гидролиз? Надо ли останавливать процесс чем-то типа фосфорной кислоты? И что такое 1:5? Раствор трипсина к раствору белка?

Полно, но miscleavages всегда какие-то будут. Останавливать не надо, тем то трипсин и хорош. Разьест по лизинам и аргининам, и все (в отличие от химотрипсина который все разнесет в щепки, если его не тормознуть). 1:5 соотношение по массе (типа, на кило сахара 5 кило г...Войнович (с)) 1, конечно, трипсин,

4. Насколько чувствителен трипсин к размеру пептидов? Если, например, идут подряд несколько глицилов, отдельные остатки трипсин выщепит? Стоит ожидать их пиков? Нужно калибровать колонку по отдельным аминокислотам (для трипсина, если я правильно помню, это глицин и аргинин)?

Добрый совет, возьмите любую книжку по биохимии. 10 мин, и вы в теме. Про пики не понял, кого и куда калибровать надо? И зачем?

optima
Пользователь
Ранг: 322

31.05.2007 // 18:13:52

Редактировано 1 раз(а)

Постарайтесь максимально точно сделать по фармакопее. По концентрации белка соориентируетесь методом проб и ошибок. Обязательно нужен стандартный образец с приложеной к нему хроматограммой. И обязательно нужно его прогнать на вашей колонке.
Не всегда образец нужно восстанавливать ДДТ, смотрите фармакопею. Пептидов всегда больше, чем вы себе нарисуете исохдя из аригнина и лизина. Так как аминокислоты окисляются, дезаминируются и т.д. Теоретически количество пептидов вы не рассчитаете.
Для трипсина очень важен рН. Трис-ацетатный буфер - типичный дл трипсина. хлорид кальция добавляют для стабилизации фермента, но опыт показывает, что работает и без него.

Яра
Пользователь
Ранг: 10

01.06.2007 // 13:53:35

Редактировано 2 раз(а)

Да-а-а. Чего-то меня с глицином проглючило, конечно лизин. Сорри.

А 4 мм чего? Внутренний диаметр? А как вы догадались что она такая? ))))

Врубилась таки зачем там твин, видимо, для разворачивания олигомеров белка.

Про восстановители в фармакопее ничего не сказано, но если дисульфидные мостики есть (а они есть), их надо разомкнуть... что ж, вполне логично, спасибо за подсказку.

Понятно, что рН критично для трипсина. Но, как я уже сказала, белок идет в буфере около 8, только в фосфатном. Вопрос быть или не быть, менять буфер или не менять.

А что касается стандарта, таки ой. В конечном итоге, мне этот стандарт и создавать.

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Аквадистиллятор из нержавеющей стали UD-1100
Предназначены для производства дистиллированной воды, отвечающей требованиям государственной фармакопеи. Применяются в медицинских учреждениях, аптеках, лабораториях и для технических нужд. Производительность - не менее 10 л/ч. Мощность: 7,5 КВт.

[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]

optima
Пользователь
Ранг: 322

01.06.2007 // 14:07:31

Редактировано 2 раз(а)

А в брит фармакопее вы смотрели метод картирования вообще или применительно к вашему белку? У вас уникальный белок, не фармакопейный? в списке стандартов EDQM его нет?
буфер можете и не менять - восьмерка для трипсина почти оптимум, но вам же трипсин в чем-то тоже надо растворить, не прямо же его в образец сыпать. Мы делаем стоки в трис-ацетатном и храним на минус 20 годами в мелкой фасовке.

Яра
Пользователь
Ранг: 10

01.06.2007 // 15:30:30

optima пишет:
А в брит фармакопее вы смотрели метод картирования вообще или применительно к вашему белку? У вас уникальный белок, не фармакопейный? в списке стандартов EDQM его нет?
буфер можете и не менять - восьмерка для трипсина почти оптимум, но вам же трипсин в чем-то тоже надо растворить, не прямо же его в образец сыпать. Мы делаем стоки в трис-ацетатном и храним на минус 20 годами в мелкой фасовке.

Белок уникальный, не фармакопейный.

Поскольку для трипсина важен рН, а не состав (так?), то значит и растворить его можно в том же буфере, что и искомый белок. Также и хранить.

Извините за дилетантизм, а что такое EDQM?

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

01.06.2007 // 15:50:45

Яра пишет:

Врубилась таки зачем там твин, видимо, для разворачивания олигомеров белка.

Поаккуратнее с этой пакостью (может, и ну его, а!? твин / тритон сыплють чтобы гидрофобные белки в растворе удержать, как денатурант он никакой). Они светят в UV со страшной силой, дают кучу пиков олигомеров, а масс-спек уничтожают на корню (не совсем так безнадежно, но проблем огребете).

Трипсину на буфер плевать, лишь бы pH была так 7.5-9. Посмотрите чтоб вам там меркапто в буффер не включили, это трипсин убивает (будете алкилировать после восстановления, 2х кратный мольный избыток жОстко держать! Сорри, но напомните студенту / лаборатну что в DTT 2 тиола - любимый студенческий косяк)

optima
Пользователь
Ранг: 322

01.06.2007 // 17:02:05

Редактировано 1 раз(а)

(EDQM): Европейский Директорат по качеству лекарств www.edqm.org . На этом сайте есть ttp://www.edqm.eu/medias/fichiers/crs_no_48.pdf - каталог стандартов - Chemical Reference Substances. Мы покупаем именно здесь. Перечень стандартов больше, чем фармстатей.
Стандарт создать самому это конечно очень круто. Почти как вечный двигатель. Но если вы - первопроходцы, то иного пути у вас нет.

Islander
VIP Member
Ранг: 1065

01.06.2007 // 17:08:35

Spectrometrist пишет:
Они светят в UV со страшной силой, дают кучу пиков олигомеров, а масс-спек уничтожают на корню

Пожалуй, не столько светят, сколько поглощают. А насчет МС, то какие у Bас планы на следующей неделе (off-topic)?


Ответов в этой теме: 16 Страница: 1 2 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты