Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

LC-MS: MRM, MSM? >>>

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: LC-MS: MRM, MSM?
zinj
Пользователь
Ранг: 19

16.03.2007 // 15:20:58     
Помогите, пожалуйста, ликвидировать безграмотность:
если я правильно понимаю, то MRM (multiple reaction monitoring) режим - это, по сути, тоже самое, что и SRM (selected reaction monitoring) режим. А что такое MSM (multi sequence mode), в чем его отличие от MRM? Или это вообще две вещи, между собой несвязанные?
Спасибо.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


16.03.2007 // 16:51:32     
Насколько я знаю, MSM термин не вполне общеупотребимый. Я его слышал в контексте анализа когда в одном цикле используют несколько разных сканов, например: MS survey (pos) -> precursor ion scan (neg) -> zoom scan (pos) -> MS/MS (pos) и все по новой. Идея такой безумной цепочки в МS/MS специфических ионов, коротые видны и на на precursor scan и на MS survey одновременно.

Но я не настаиваю - может это был сленг одной фирмы?
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


17.03.2007 // 20:48:46     

Spectrometrist пишет:
может это был сленг одной фирмы?
Совершенно верно, в этом контексте это тремин, используемый в софте фирмы Shimadzu.
Общепринятый термин MSM (Multiple-scattering method) - совсем из другой оперы и относится к квантовомеханическим расчетам.
zinj
Пользователь
Ранг: 19


21.03.2007 // 15:15:21     
Еще раз прошу прощения, если мои вопросы кажутся неграмотными.
Если я правильно понимаю, режимы Scan, SIM (selected ion monitoring) и TIC (total ion current) используются в масс-спектрометрии для детекции целых ионов аналита.
Тогда как режимы MRM (multiple reaction monitoring)и SRM (selected reaction monitoring) - для детекции уникальных фрагментов.
Исходя из этого, у меня возникает вопрос: возможно ли количественное определение стероидных гормонов (кортизол, прогестерон, тестостерон) в сыворотке крови методом LC-MS в режиме SIM при использовании дейтерированных внутренних стандартов? Хватит ли чувствительности метода при использовании SIM-режима?
Чувствительность метода должна быть меньше:
5 нмоль/л для кортизола
0,5 нмоль/л для прогестерона
0,2 нмоль/л для тестостерона
Спасибо.
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


21.03.2007 // 18:51:35     
TIC (total ion current) это метод отображения хроматограммы. Как таковой, он не детектирует ничего специфически - ну, как народный акын из анекдота - "чего вижу, о том пою", а о чем петь ему без разницы. Видит правильный ион - хорошо, видит грязь - и это покатит

"тогда как режимы MRM (multiple reaction monitoring)и SRM (selected reaction monitoring) - для детекции уникальных фрагментов". Да, но добавлю - из уникальных precursor(s). Т.е. вы ему должны сказать, какую массу / массы долбить в collision cell (ну или в trap, чего есть)
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


22.03.2007 // 0:15:01     

zinj пишет:
возможно ли количественное определение стероидных гормонов (кортизол, прогестерон, тестостерон) в сыворотке крови методом LC-MS в режиме SIM при использовании дейтерированных внутренних стандартов? Хватит ли чувствительности метода при использовании SIM-режима?
Чувствительность метода должна быть меньше:
5 нмоль/л для кортизола
0,5 нмоль/л для прогестерона
0,2 нмоль/л для тестостерона

Да уж, Вам не позавидуешь. 0,2 нмоль/л для тестостерона это порядка 50 пг/мл, а эти стероидные гормоны весьма плохо ионизируются. Задача совершенно не для начинающего. Вы хоть литературу-то посмотрели? (не на русском, конечно!) Для начала, было бы неплохо представлять какими источниками Вы располагаете (ESI, APCI, APPI ?). Далее, не пойму, чего Вам дался SIM режим. Если я не ошибаюсь, у Вас тройной квадруполь. Комечно, без фрагментации абсолютный сигнал будет выше, но и нулевая и шумы тоже, да и матрица даст свой вклад в виде изобарических примесей. Такие вещи, если прибор позволяет, всегда делают в MRM. В этом случае можно получить приличное отношение сигнал/шум и хорошо отделиться от всех мешающих ионов. Дейтерированные внутренние стандарты этому не помеха, при условии, что примесь недейтерированного вещества невелика. Чаще всего, так оно и есть, по крайней мере, в 95% случаев.
Еще раз советую посмотреть статьи, опубликованные в научных журналах по этой теме (к счастью, публикаций много!). Посмотрите, проанализируйте, выберите стратегию пробоподготовки, и я с удовольствием обсужу с Вами эту тему более конкретно.
Не советую пытаться делать "в лоб" без анализа литературы. Могу заверить, набъете много шишек и потеряете много времени.
Что же касается общего ответа на поставленный вопрос, то да, в принципе возможно. Но к решению этой задачи есть несколько подходов, зависящих от Вашего оборудования (о коем у меня только смутное представление).
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Аврора-ИТ, ЗАО Аврора-ИТ, ЗАО
Компания Аврора-ИТ специализируется на внедрении информационных технологий класса LIMS (Лабораторных Информационных Систем) на предприятиях различных отраслей промышленности. Компания осуществляет полный комплекс услуг по внедрению ПО, включая сопровождение и техническую поддержку. Компания предлагает средство для автоматизации ВЛК согласно требованиям ГОСТ Р ИСО 5725 – программу «Lab5725X».
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


22.03.2007 // 2:00:24     
Islander, а что, этот FAIMS от Thermo как там их сейчас, действительно такакя революционная штука? Они ведь на triple quad его предлагают навьючивать, так?
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


22.03.2007 // 2:12:37     

Spectrometrist пишет:
Islander, а что, этот FAIMS от Thermo как там их сейчас, действительно такакя революционная штука? Они ведь на triple quad его предлагают навьючивать, так?
Я разговаривал с первыми пользователями и разработчиками этого устройства задолго до того, как Thermo их скупила на корню. Пытался получить образец для испытаний у нас, но не вышло. По тому что слышал и видел, вещь полезная. Но дорогая. И, конечно, не панацея от всех бед. Без головы на плечах все равно не поможет...
В отдельных случаях может позволить сэкономить время и решать задачу "в лоб" без необходимости поиска оригинальных обходных путей.
zinj
Пользователь
Ранг: 19


22.03.2007 // 9:58:40     
Редактировано 3 раз(а)


Islander пишет:

Да уж, Вам не позавидуешь. 0,2 нмоль/л для тестостерона это порядка 50 пг/мл, а эти стероидные гормоны весьма плохо ионизируются.

Совершенно верно, 57,684 пг/мл. Судя по литературным данным, нижняя граница чувствительности API-4000 по стероидам - 10 пг/мл. У LCMS-2010 данных по стероидам не нашел, написано, что тоже высокая чувствительность


Вы хоть литературу-то посмотрели? (не на русском, конечно!)

Да, анализ литературы провел. А на русском вообще есть что-то подобное?


Для начала, было бы неплохо представлять какими источниками Вы располагаете (ESI, APCI, APPI ?).

Есть возможность использовать любой из перечисленных источников, но т.к. стероиды - низко-полярные соединения, естественно предпочтительней будет использовать фотоионизацию при атмосферном давлении.


Далее, не пойму, чего Вам дался SIM режим. Если я не ошибаюсь, у Вас тройной квадруполь. Комечно, без фрагментации абсолютный сигнал будет выше, но и нулевая и шумы тоже, да и матрица даст свой вклад в виде изобарических примесей. Такие вещи, если прибор позволяет, всегда делают в MRM. В этом случае можно получить приличное отношение сигнал/шум и хорошо отделиться от всех мешающих ионов. Дейтерированные внутренние стандарты этому не помеха, при условии, что примесь недейтерированного вещества невелика. Чаще всего, так оно и есть, по крайней мере, в 95% случаев.

Абсолютно согласен, что во всех статьях по этой теме указывается MRM-режим. SIM-режим мне дался лишь потому, что у LCMS-2010 есть только три режима: Scan, SIM, и, названный вами сленговым, MSM-режим. Конечно, было бы проще, не мудрить, а использовать для этих целей API-3000, но фирма занимающаяся продажей LCMS-2010 любезно предложила опробовать нашу методику в своей стендовой лаборатории, территориальное расположение которой подкупает своей близостью. Возможностей апробации методики на API-3000/4000 в Питере я, к сожалению, не нашел.


Еще раз советую посмотреть статьи, опубликованные в научных журналах по этой теме (к счастью, публикаций много!). Посмотрите, проанализируйте, выберите стратегию пробоподготовки, и я с удовольствием обсужу с Вами эту тему более конкретно.

Стратегия пробоподготовки такова (по данным литературы):
Реагентика:
1. Аналиты
2. Дейтерированные внутренние стандарты
3. Bio-Rad контроли
4. Метанол (Optima grade, ОСЧ)
5. БСА (96%)
6. Ацетонитрил (Optima grade, ОСЧ)
7. Вода для ВЭЖХ
8. Аммония ацетат
9. Толуол (Optima grade, ОСЧ)

Аналиты:
a. Кортизол (4-pregnen-6β, 11β, 21-triol-3, 20-dione)
Молекулярная масса: 362.46
b. Прогестерон (4-pregnen-3, 20-dione)
Молекулярная масса: 314.46
c. Тестостерон (4-androsten-17β-ol-3-one)
Молекулярная масса: 288.42
d. Дегидроэпиандростерон-сульфат (5-androsten-3β-ol-17-one sulphate, sodium salt)
Молекулярная масса: 390.47
Стоковые растворы аналитов с концентрацией 1 мг/мл готовятся в метаноле и хранятся при -20°С.
Промежуточные стоки аналитов в метаноле:
1. Кортизол - 68.1 мкг/мл
2. Прогестерон - 3.31 мкг/мл
3. Тестостерон - 2.09 мкг/мл
4. Дегидроэпиандростерон-сульфат - 469.4 мкг/мл
Калибровочные пробы (КП) готовятся путем разведения промежуточного стока аналита 4% водным раствором БСА в 10, 20, 100, 200, 500, 1000 раз. Седьмая КП – blank (раствор БСА).
КП необходимы для построения калибровочной кривой (КК) с клинически значимым диапазоном концентраций для каждого аналита.

Внутренние стандарты, меченные дейтерием:
a. Кортизол-9,11,12,12-d4 (cortisol-9,11,12,12-d4)
b. Прогестерон-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d9 (progesterone-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d9)
c. Тестостерон-1,2-d2 (testosterone-1,2-d2)
d. В качестве внутреннего стандарта для дегидроэпиандростерон-сульфата используется тестостерон-1,2-d2

Растворы внутренних стандартов с концентрацией 80 нг/мл готовятся в ацетонитриле.
Внутренние стандарты необходимы также для преципитации белков в КП или сыворотке.
Приготовление пробы
В 2 миллилитровую, коническую, пластиковую, центрифужную пробирку добавляется 760 мкл КП или сыворотки и 1140 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле.
Пробирка закрывается, откручивается на вортексе в течение 30 с и центрифугируется 10 мин при 13 000 g.
Супернатант объемом 1700 мкл помещается в емкость автосамплера LC-MS для инъекции в хроматографическую колонку.
Пробоподготовка происходит при комнатной температуре.
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


23.03.2007 // 2:02:09     

zinj пишет:
Судя по литературным данным, нижняя граница чувствительности API-4000 по стероидам - 10 пг/мл. У LCMS-2010 данных по стероидам не нашел, написано, что тоже высокая чувствительность

Ну, на заборе и не то бывает написано... Начну с того, что Вы пытаетесь сравнить приборы совершенно разных классов. API-4000 - тройной квадруполь, один из лучших на рынке, а LCMS-2010 - ширпотребный простой квадруполь, потому в нем и нет MRM-режима.
Продавцы могут Вам и не такой лапши на уши навешать. Лично я на LCMS-2010 за Вашу задачу просто не взялся бы, хотя никогда и не пробовал на нем работать. Если не верите моему чутью, можете попытаться.
На API-4000 Ваша задача точно решаема, хотя попотеть придется, особенно с хроматографией. Она, скорее всего, решаема и на API-3000, но не со столь простой пробоподготовкой.


Да, анализ литературы провел. Есть возможность использовать любой из перечисленных источников, но т.к. стероиды - низко-полярные соединения, естественно предпочтительней будет использовать фотоионизацию при атмосферном давлении.

Сразу видно, что с литературой Вы работали, и это прекрасно! Хотя должен отметить, что если для недериватизированных нейтральных стероидов лучше всего использовать именно APPI с положительной ионизацией, то Дегидроэпиандростерон-сульфат даст лучший отклик на ESI с отрицательной ионизацией. Скорее всего он даст приемлемый сигнал и на APPI, ибо его много, но не исключено, что придется переключать полярность.
Есть также еще один подход, который даст максимальную чувствительность - ESI со специфической дериватизацией то кетогруппе (полагаю, Вы это тоже видели в литературе). Этот вариант даст достаточный сигнал даже на API-3000, но заведомо сложнее как в плане пробоподготовки, так и хроматографически.


Конечно, было бы проще, не мудрить, а использовать для этих целей API-3000, но фирма занимающаяся продажей LCMS-2010 любезно предложила опробовать нашу методику в своей стендовой лаборатории, территориальное расположение которой подкупает своей близостью. Возможностей апробации методики на API-3000/4000 в Питере я, к сожалению, не нашел.

Главная проблема при работе с биологическим образцами при таких чувствительностях - посторонние пики из матрицы. Не исключено, что чувствительности на стандартах Вам хватит и в SIM. Но эти пики Вам забъют весь полезный сигнал, как только Вы станете работать с сывороткой. Фрагментирование с последующей масс-спектроскопической фильтрацией дочерних ионов (MRM) позволяет выделить только те ионы, которые разваливаются на правильные фрагменты, что резко улучшает картину. Хотя у интересующих Вас веществ полно эндогенных изомеров, так что без хорошей хроматографии Вам не обойтись.


1. Кортизол
2. Прогестерон
3. Тестостерон
4. Дегидроэпиандростерон-сульфат
Внутренние стандарты, меченные дейтерием:
a. Кортизол-9,11,12,12-d4 (cortisol-9,11,12,12-d4)
b. Прогестерон-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d9 (progesterone-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d9)
c. Тестостерон-1,2-d2 (testosterone-1,2-d2)
d. В качестве внутреннего стандарта для дегидроэпиандростерон-сульфата используется тестостерон-1,2-d2

Тут еще одна большая пакость. Если бы у Вас были только нейтральные стероиды, можно было бы упростить хроматографию, сделав ее в нормальной фазе и добавив толуол прямо в ПФ. А так, если Вы хотите получить все в одном заколе, Вы обречены на градиент в обращенке, ибо Дегидроэпиандростерон-сульфат гораздо полярнее всего остального. Учитывая сказанное, выбор внутреннего стандарта для него совершенно неподходящий, тем более что ионизация в APPI весьма подвержена матричному подавлению. Ищите какой-нибудь близкий по структуре неэндогенный стероидный сульфат (задача может оказаться нетривиальной).


Приготовление пробы
В 2 миллилитровую, коническую, пластиковую, центрифужную пробирку добавляется 760 мкл КП или сыворотки и 1140 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле.
Пробирка закрывается, откручивается на вортексе в течение 30 с и центрифугируется 10 мин при 13 000 g.
Супернатант объемом 1700 мкл помещается в емкость автосамплера LC-MS для инъекции в хроматографическую колонку.

Такой подход к пробоподготовке наиболее прост, но и дает, с одной стороны, весьма грязный экстракт, таящий в себе много сюрпризов, как в виде интерферирующих пиков, так и в плане влияния на ионизацию. С другой стороны, неизбежно 3-х кратное разбавление пробы, требующее более высокой чувствительности прибора. Однозначно, это только API-4000 под силу.
Использование ТФЭ со смешанным обращенно-фазным/анионообменным механизмом (Oasis MAX, Waters) может позволить вместо разбавления образец сконцентрировать, а при необходимости, отделить фракцию с нейтральными стероидами от фракции с Дегидроэпиандростерон-сульфатом. Учитывая большую разницу в хроматографических и масс-спектрометрических свойствах, раздельный анализ может оказаться более удобным. Мне кажется, что с концентрированием раза в 2.5-5 вам может хватить чувствительности и на API-3000.
zinj
Пользователь
Ранг: 19


23.03.2007 // 14:44:38     
Уважамый Islander, огромное спасибо за советы! Они бесценны, но честно признаюсь, иногда моего медицинского образования бывает недостаточно, чтобы понять их

Islander пишет:

zinj пишет:
Судя по литературным данным, нижняя граница чувствительности API-4000 по стероидам - 10 пг/мл. У LCMS-2010 данных по стероидам не нашел, написано, что тоже высокая чувствительность

Ну, на заборе и не то бывает написано...

Хочу разобраться в определениях, возможно, мы с Вами говорим о разных вещах.
По литературным данным, LoQ – limit of quantitation (предел количественного определения) API-3000 для тестостерона, например, составляет 0,347-0,69 нмоль/л или 100-199 пг/мл (по разным работам).
Говоря о требуемой чувствительности для тестостерона - 0,2 нмоль/л или 57,684 пг/мл, я имел в виду LoD – limit of detection (предел обнаружения).
Исходя из этого, не могли бы Вы предположить значения LoD по стероидам для API-3000 (MRM-режим) и LCMS-2010 (SIM-режим), а также значения LoQ по стероидам для LCMS-2010 (SIM-режим)?


Начну с того, что Вы пытаетесь сравнить приборы совершенно разных классов. API-4000 - тройной квадруполь, один из лучших на рынке, а LCMS-2010 - ширпотребный простой квадруполь, потому в нем и нет MRM-режима.

Да, я понимаю, что LCMS-2010 даже не тандемный масс-спектрометр


На API-4000 Ваша задача точно решаема, хотя попотеть придется, особенно с хроматографией.

Хроматография планируется следующая:
автосамплер (Shimadzu SIL-HT) при комнатной температуре впрыскивает аликвоты в хроматографическую колонку (Supelco LC-18-DB, 3.3 cm x 3.0 mm, 3.0-mm внутренний диаметр), оснащенную защитной колонкой (Supelco Discovery C-18, 3.0 mm) с идентичным наполнителем (Supelco, St Louis, Mo).
Стероиды оседают на колонке, которая промывается р-ром С (смесь, содержащая 15 мМ р-р аммония ацетата и вода-метанол (объемные доли 98:2, pH 5.5) со скоростью 1 мл/мин.
После 5 минут промывки срабатывает редуктор и колонка элюируется градиентом р-ров А (вода-метанол, объемные доли 98:2) и B (метанол) со скоростью 0,5 мл/мин (A/B: 100/0 – 5 мин, 50/50 – 7 мин, 45/55 – 11 мин, 40/60 – 14,5 мин, 20/80 – 17,9 мин, 100/0 – 18 мин).
Затем образец поступает в масс-спектрометр. Перед следующим впрыском колонка промывается 100% р-ром B в течение 4 минут.


Есть также еще один подход, который даст максимальную чувствительность - ESI со специфической дериватизацией то кетогруппе (полагаю, Вы это тоже видели в литературе). Этот вариант даст достаточный сигнал даже на API-3000, но заведомо сложнее как в плане пробоподготовки, так и хроматографически.

В том-то и дело, что одна из поставленных передо мной задач - максимально упростить процесс пробоподготовки.


Главная проблема при работе с биологическим образцами при таких чувствительностях - посторонние пики из матрицы. Не исключено, что чувствительности на стандартах Вам хватит и в SIM. Но эти пики Вам забъют весь полезный сигнал, как только Вы станете работать с сывороткой. Фрагментирование с последующей масс-спектроскопической фильтрацией дочерних ионов (MRM) позволяет выделить только те ионы, которые разваливаются на правильные фрагменты, что резко улучшает картину. Хотя у интересующих Вас веществ полно эндогенных изомеров, так что без хорошей хроматографии Вам не обойтись.

Описанная мной выше методика хроматографии подойдет?


Тут еще одна большая пакость. Если бы у Вас были только нейтральные стероиды, можно было бы упростить хроматографию, сделав ее в нормальной фазе и добавив толуол прямо в ПФ. А так, если Вы хотите получить все в одном заколе, Вы обречены на градиент в обращенке, ибо Дегидроэпиандростерон-сульфат гораздо полярнее всего остального. Учитывая сказанное, выбор внутреннего стандарта для него совершенно неподходящий, тем более что ионизация в APPI весьма подвержена матричному подавлению. Ищите какой-нибудь близкий по структуре неэндогенный стероидный сульфат (задача может оказаться нетривиальной).

Нет, планируется проводить отделный анализ на каждый из перечисленных стероидных гормонов. Определение стероидного профиля не требуется.

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты