Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Анализ биожидкостей >>>

  Ответов в этой теме: 12
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Анализ биожидкостей
Slawa
Пользователь
Ранг: 323

14.02.2007 // 19:32:09     
Здравствуйте!
Поставлена задача: определить концентрацию антибиотика в сыворотке крови методом ВЭЖХ. Уровень концентрации составляет порядка 1-5 мкг/мл, связывание с белками 70-80%.

Я полагаю, что т.к. содержание белков крови у различных пациентов будет отличаться, то на стадии пробоподготовки (методом ТФЭ или экстракции) возможно возникновение значительных погрешностей определения. Поэтому определять концентрацию можно только методом внутреннего стандарта (после внесения в пробу крови известного количества структурного аналога антибиотика).

Верно ли это, или существуют способы учёта таких погрешностей?
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


14.02.2007 // 22:58:12     

Slawa пишет:
Здравствуйте!
Поставлена задача: определить концентрацию антибиотика в сыворотке крови методом ВЭЖХ. Уровень концентрации составляет порядка 1-5 мкг/мл, связывание с белками 70-80%.

Я полагаю, что т.к. содержание белков крови у различных пациентов будет отличаться, то на стадии пробоподготовки (методом ТФЭ или экстракции) возможно возникновение значительных погрешностей определения. Поэтому определять концентрацию можно только методом внутреннего стандарта (после внесения в пробу крови известного количества структурного аналога антибиотика).

Верно ли это, или существуют способы учёта таких погрешностей?

Верно, использование внутреннего стандарта как раз таким способом и является. Кстати, не надо думать, что связанный с белками антибиотик не будет извлекаться методами ТФЭ или жидкостной экстракции. В большинстве случаев можно подобрать условия, чтобы степень извлечения была не хуже 70%. Недавно это уже обсуждалось:
www.anchem.ru/forum/read.asp?id=3943&recordnum=17
А какой антибиотик, если не секрет?
Slawa
Пользователь
Ранг: 323


16.02.2007 // 18:26:55     
Большое спасибо за ответ.

Когда что-то впервые делаешь - хочется услышать ответ специалиста, что делаешь правильно.

Антибиотик - эритромицин.
Slawa
Пользователь
Ранг: 323


16.02.2007 // 19:12:07     
Редактировано 1 раз(а)

Кстати тут возникает ещё один вопрос: Эритромицин поглощает в короткой УФ - области и детектировать его можно при длине волны до 220 нм. Отсюда низкая чувтвительность и высокие требования к чистоте растворителей. Флуориметрического же детектора у нас нет.

Вопрос: существует ли (как бы это назвать) послеколоночные картриджи, которые могли бы модифицировать структуру антибиотиков макролидов таким образом, чтобы они поглощали в видимой области. Если такое есть - кто это производит? (или как правильно называется)
sp
Пользователь
Ранг: 5


16.02.2007 // 19:59:14     
Уважаемый Slawa ...Вы наверняка делаете обращенно-фазовый вариант...колонка С18...
Поделитесь пожалуйста какую используете подвижную фазу ...какой градиент(если есть)...
Slawa
Пользователь
Ранг: 323


16.02.2007 // 21:06:50     

sp пишет:
Уважаемый Slawa ...Вы наверняка делаете обращенно-фазовый вариант...колонка С18...
Поделитесь пожалуйста какую используете подвижную фазу ...какой градиент(если есть)...


Я пока что ничего не делаю, только копаю литературу. Использовать видимо буду C18, фосфатный буфер-ацетонитрил.
И вообще специалистом себя не считаю, потому что за хроматограф сел совсем недавно.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
СИБЭКОПРИБОР, ПЭП, ООО СИБЭКОПРИБОР, ПЭП, ООО
Производит и поставляет: Анализаторы нефтепродуктов, жиров и НПАВ в водах, вспомогательное оборудование, термостаты, лабораторные экстракторы и пробоотборные системы. Аттестованные методики выполнения измерений. ГСО нефтепродуктов и жиров в воде.
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


17.02.2007 // 3:25:02     

Slawa пишет:
Кстати тут возникает ещё один вопрос: Эритромицин поглощает в короткой УФ - области и детектировать его можно при длине волны до 220 нм. Отсюда низкая чувтвительность и высокие требования к чистоте растворителей. Флуориметрического же детектора у нас нет.

Вопрос: существует ли (как бы это назвать) послеколоночные картриджи, которые могли бы модифицировать структуру антибиотиков макролидов таким образом, чтобы они поглощали в видимой области. Если такое есть - кто это производит? (или как правильно называется)

Могу Вам только посочувствовать, Вы попали конкретно. Флуорометрический детектор Вам в дюбом случае без интереса, а вот электрохимический не помешал бы - большая часть работ по определению макролидов в биологических объектах сделана именно с ним (на втором месте - LC-MS, как у меня).
Той штуки, о которой Вы мечтаете, для этого случая не существует, и вообще, послеколоночная дериватизация возможна лишь в очень редких случаях. Вам остается либо мучиться с низкими длинами волн, оптимизируя экстракцию и хроматографию дабы отделиться от мешающих компонентов сыворотки (а мешать будет все), либо дериватизировать до хроматографии.
Первый путь может дать приемлемые результаты, но трудности я Вам обещаю:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=8376485
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=15686985
Второй путь тоже возможен, так как эритромицин это кетон. Надо только чтобы и внутренний стандарт тоже был кетоном. Кларитромицин, например, подойдет. Можно использовать ДНФГ. А можно посмотреть статью:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=10932853
Селективность будет выше, хроматография проще, время анализа можно будет сделать короче, но пробоподготовка может оказаться достаточно сложной. Выбирать вам.
valerra
Пользователь
Ранг: 141


18.02.2007 // 22:46:53     

Slawa пишет:
Здравствуйте!
Поставлена задача: определить концентрацию антибиотика в сыворотке крови методом ВЭЖХ. Уровень концентрации составляет порядка 1-5 мкг/мл, связывание с белками 70-80%.
Чтобы не усложнять себе существование я в случаях необходимости анализа лекарств в кровях поступаю просто: беру кровь, отстаиваю при комнатной температуре , центрифугирую при 3000 об/мин 15 мин, отбрасываю тромб и получаю сыворотку. Беру 1 мл сыворотки, приливаю три мл ацетонитрила (соотношение соблюдать точно!) -- выпадают белки, центрифугирую 15 мин при 3000 об/мин (чем больше оборотов -- тем лучше). Полученный раствор обезжириваю гексаном, фильтрую и колю в хроматограф.
Тут может быть облом -- некоторые фильтры сажают на себе определяемые вещества -- количественно сажают. Жирорастворимое лучше не фильтровать через тефлоновые фильтры, а соли металлов -- через целлюлозу.
По опыту знаю -- теоретически подобрать фазу нереально. Обычно я начинаю с Зорбакс XDB С-6, не помогает -- перехожу к XDB С-18, затем BDS С-18. Как подвижную фазу люблю использовать гептансульфокислоты натриевую соль с С=10 Ммоль/л (можно больше -- но это дорогое удовольствие) в воде с добавлением 1,0-2,0 мл фосфорной кислоты на 1 л.
Мне нарвится эта система -- не нужно устанавливать рН, но подходит и обычный фосфатный буфер.
Органическая фаза -- ацетонитрил сорта О. Беру 10% водной фазы и ищу колонку, на которой стандарт будет выстреливать сразу после реакции системы на ввод. Иногда пик совпадает с этой самой реакцией -- в таком случае после подачи стандарта кран не закрываю, а подаю элюэнт через петлю.
Принцип метода в том, что среда крови -- щелочная, щелочные вещества здорово зависают на колонке с кислотным элюентом. После того, как выскочило определяемое вещество даю градиент, увеличивая ацетонитрил до 90% примерно за 30 мин и иду пить пиво -- пиков будет много. Очень много. На новой колонке удается разглядеть при 200 нм до 180 пиков, отрицательные пики тоже не должны смущать.Потом пиков становится все меньше и меньше -- после 200 анализов может быть вообще 2 пика -- определяемого вещества и все остальное. Еще 10 мин отмываю чистым ацетонитрилом.
Иногда метод не работает по причине низкой концентрации определяемого вещества -- тогда пытаюсь колоть его в ГЖХ. Не помогает -- варю в трифторуксусном ангидриде и еще раз колю, не летит -- пытаюсь получить ТМС производные и колю в последний раз. Потом иду к заказчику и говорю "извиняй, братан, не получилось". Еслми заказчик настаивает на проведении исследования, звоню в местную фирму, поставляющую патроны для ТФЭ (стоят 3-4 бакса за 1 шт, заказываю 200 шт). Заодно прошу колонку в счет ввернуть (еще штука, полторы зеленых). Беру счет и несу к заказчику -- не было в моей практике случая, что бы ко мне еще раз после этого пытались приставать.
GCuber
Пользователь
Ранг: 15


19.02.2007 // 1:28:12     
Посоветую постколоночную иммунохимическую дериватизацию, особенно если есть флуориметрический детектор
Slawa
Пользователь
Ранг: 323


19.02.2007 // 21:34:47     
to Islander: большое спасибо за ссылку в The Analyst.

to GCuber: к сожалению флуориметрического детектора у нас нет.

to valerra: может подскажете, где бы почитать в чём принципиальное отличие между различными марками хроматографических колонок, например, XDB С-18 и BDS С-18?
valerra
Пользователь
Ранг: 141


20.02.2007 // 1:33:29     
Редактировано 1 раз(а)


Slawa пишет:
to valerra: может подскажете, где бы почитать в чём принципиальное отличие между различными марками хроматографических колонок, например, XDB С-18 и BDS С-18?
Описание колонок Зорбакс, включая расшифровку абревиатур, принцип их работы, формулы привитой фазы и стратегию разработки метода анализа есть в представителствах Agilent Tehnologies в переводе на русский язык в виде отдельной брошюрки с цветными картинками. Года три назад я им позвонил -- по факсу сбросили копию.

  Ответов в этой теме: 12
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты