Форумы ANCHEM.RU: Изменение времени удерживания на разных ВЭЖХ колонках одной марки

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Изменение времени удерживания на разных ВЭЖХ колонках одной марки >>>

  Ответов в этой теме: 33
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306

24.11.2011 // 19:54:16

Редактировано 1 раз(а)

optima пишет:
Спасибо! огромное!!! Завтра все попробую.
Изопропанол взялся из фармакопеи.(((
Исходно было 3% (объемных).

Ах 3%.... тогда ПРОСТО ДОБАВЬ СОЛИ!

ну, до 40С тоже можно температурку поднять. пишут же - можно

вообще сделать 0.1М - и нормуль.. и "старая" колонка вдруг окажется "новой"

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

virtu
VIP Member
Ранг: 2136

24.11.2011 // 19:57:01

Редактировано 3 раз(а)

optima пишет:

Кондиционирование - это что?

1. Вы получили новую колонку. Она "законсервирована" (состав элюента должен быть указан в паспорте), соотв. нужно правильно "разконсервировать" и подготовить колонку к работе.
Кондиционирование - уравновешивание - установление физ.-хим. равновесия в системе элюент-сорбент (нужно прокачать через колонку опред. объем рабочего элюента при пост. температуре и т.д.).

2. Замечу, что в фармстатье правильно указывается ИПС (3%v), т.к. сорбенты бывают разные, где-то нужно добавлять ИПС (1-5%v), а где-то и нет. На диольных сорбентах (YMC) при работе с различными белками не сталкивался с тем, чтобы 1-3%v орг. спирта (ИПС, метанол) могли так координально изменить поведение аналита.
Хотя, от греха, его стоит совсем убрать или уменьшить до 1%v.

3. Сорбент 300А у Вас, если не ошибаюсь. 20кДа должен выходить (в мертвом объеме) относительно рядом с низкомолекулярным несорбируемым компонентом.

З.Ы.: Думаю, надо сначала все нормально уравновесить, проверить (банальные ошибки) и т.д. Если не прокатит, то, как говорит Констанин, поднимать концентрацию буфера до 0,1М. Обычно юзаю для белков 200mМ NaCl + 25-100mM фосфатного буфера.

optima
Пользователь
Ранг: 323

25.11.2011 // 8:42:38

Простите за настойчивость, но мне кажется, я запуталась.
Не могу я соль добавить. В этом случае белок действительно выйдет раньше глицина, но при этом не разделятся димеры и полимеры от мономера, что и есть моей целью.

КонстантинС
"Там выходит все, что НЕ эксклюдируется (то есть заходит во все поры) и НЕ удерживается. Предположим, что глицин как раз выходит в нуле (поскольку от смены условий он никуда не сдвигается)."

То есть, каким бы буфером я бы не работала, глицин будет при одной скорости выходит в одно и то же время? (надо проверить).
Если так, то это норма для этой колонки, а не брак?

Волгин
VIP Member
Ранг: 1335

25.11.2011 // 12:12:20

Редактировано 1 раз(а)

optima пишет: ...То есть, каким бы буфером я бы не работала, глицин будет при одной скорости выходит в одно и то же время? (надо проверить).
Если так, то это норма для этой колонки, а не брак?

Так точно! Эксклюзионная (ситовая, гель-проникающая) хроматография работает - теоретически - в условиях, когда исключены ВСЕ взаимодействия с сорбентом(ионные, гидрофобные, водородные и тому не подобные

). Читайте учебники и многое поймете сами.

optima пишет:
Простите за настойчивость, но мне кажется, я запуталась.
Не могу я соль добавить. В этом случае белок действительно выйдет раньше глицина, но при этом не разделятся димеры и полимеры от мономера, что и есть моей целью...

Если в Вашей методике колонка действительно должна работать в условиях гель-хроматографии, а похоже это действительно так: соль добавляется не только для создания необходимого рН, но и для снятия ионных взаимодействий, а изопропанол - для снятия взаимодействий гидрофобных, то на хорошо работающей колонке "димеры и полимеры" обязаны отделяться.
Кстати, поры у сорбента таких колонок - 150 ангстрём. По каталогу Аджилента.

КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306

25.11.2011 // 12:14:42

но при этом не разделятся димеры и полимеры от мономера, что и есть моей целью.

я же говорил - сразу правильно ставьте задачу, а также выкладывайте картинки

мы же не гадатели на гуще!!!

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Химико-фармацевтический журнал
Ежемесячный научно-технический и производственный журнал. Освещает молекулярно-биологические проблемы создания лекарственных средств, методы синтеза и технологии производства новых лекарственных препаратов, иccледования cтpоения xимичеcкиx cоединений, методы анализа и контpоль пpоизводcтва.

КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306

25.11.2011 // 12:24:50

Не могу я соль добавить.

Это как понимать? Табу?

но при этом не разделятся димеры и полимеры от мономера,

Тогда колонка неправильно подобрана!

optima
Пользователь
Ранг: 323

25.11.2011 // 12:32:30

Редактировано 1 раз(а)

Две одинаковые колонки. Старая и новая.
В буфере 0.025 белок делится одинаково и в старой (пока жива была) и новой.
Но глицин на старой выходил позже, на новой раньше белка.
Вот в этом и есть мой вопрос - такое можно списать на разницу между сериями колонок, или этого в принципе быть не должно и брак?

virtu
VIP Member
Ранг: 2136

25.11.2011 // 13:17:01

optima пишет:
Две одинаковые колонки. Старая и новая.
В буфере 0.025 белок делится одинаково и в старой (пока жива была) и новой.
Но глицин на старой выходил позже, на новой раньше белка.
Вот в этом и есть мой вопрос - такое можно списать на разницу между сериями колонок, или этого в принципе быть не должно и брак?

Если глицин выходит в мертвом объеме, то это ионная эксклюзия, расслабтесь. Устроили шум из ничего.

Волгин
VIP Member
Ранг: 1335

25.11.2011 // 14:17:29

virtu пишет:
Если глицин выходит в мертвом объеме, то это ионная эксклюзия, расслабтесь. Устроили шум из ничего.

Ну вот, теперь еще "ионная эксклюзия", "мертвый объем"... Забыл, что в ВЭЖХ этих "мертвых объемов" - множество - от действительно мертвого до полного?! Совсем девушку запутаешь!

optima
Пользователь
Ранг: 323

25.11.2011 // 14:40:07

Волгин пишет:

virtu пишет:
Совсем девушку запутаешь!
Ага.
Все равно не понимаю, что у меня происходит. На 22 минуте - это вряд ли мертвый объем.
Но польза от общения огромная. Скоко литературы перелопачено!


Ответов в этой теме: 33 Страница: 1 2 3 4 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты