Количественная оценка функционального состояния клеток и их взаимодействия в суспензии с помощью лазерного анализатора микрочастиц

Тезисы VII конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2004" »
Устные доклады » Секция 5. Анализ биологических, медицинских и фармацевтических объектов » ...

Количественная оценка функционального состояния клеток и их взаимодействия в суспензии с помощью лазерного анализатора микрочастиц

Шорина Г.Н., Стуров В.Г., Миндукшев И.В., Антонов А.Р.

Новосибирская государственная медицинская академия, Новосибирск

В работе представлена информация о применении лазерного анализатора микрочастиц «Ласка-Био» (НПФ «Люмекс», С-Петербург) для количественной оценки агглютинации, агрегации клеток крови, иммунного и неиммунного лизиса клеточных субстанций, а также свойств поверхности и формы клеток.

Прибор работает по принципу малоуглового светорассеяния. Интенсивность рассеяния света от лазерного источника, направленного под углом 90^о на кюветы регистрируется фотодиодами в углах: 2,4,6,8,10,12^о. Сигнал из фотодиодов через первичный блок преобразования выводится на PC. Состояние клеток, их взаимодействие, реакция клеток на регулирующие и повреждающие воздействия осуществляется в суспензии клеток, растворенных в солевой среде. Условия оптимального количества клеток и регулирующего воздействия подбирается в каждом конкретном случае.

Программное обеспечение прибора позволяет получать графическое изображение изменения состояния клеток, кинетику их взаимодействия (агглютинация, агрегация и т.д.), визуализированного на угловой диаграмме (индикатрисе), исследующего расчетные параметры: ЕС-50 – значение полумаксимальной эффективной концентрации БАВ, Umax - нормированной (по концентрации клеток) максимальной скорости взаимодействия клеток, обусловленную поверхностными свойствами клеточной мембраны, а также С- концентрации клеток в единице объема (1 мкл).

Используя запатентованную методику малоуглового светорассеяния, апробирован метод функциональной оценки клеточного взаимодействия. Количественная характеристика статуса тромбоцитов основывается на оценки величины ЕС50, которая связана с чувствительностью P2YADP-пуринорецепторов к АДФ. Вещества, увеличивающие внутриклеточную концентрацию циклических нуклеотидов, конкурентно ингибируют агрегацию. Предварительная активация тромбоцитов (без агрегации) в дальнейшем приводит к снижению чувствительности клеток к АДФ. Показана возможность аппаратной количественной регистрации реакции гемагглютинации при использовании минимального объема агглютининов и крови.

В ответ на повышение внутриклеточной концентрации кальция, активируется аденилатциклаза, и при отсутствии дополнительного стимула, необходимого для ее угнетения, клетки переходят в рефрактерное состояние. Было показано, что для развития рефрактерного состояния достаточно только активации клеток. Были оценены временные константы (k) и периоды полуразвития рефрактерного состояния (t1/2). Можно предположить, следующий сценарий процесса. В ответ на повышение внутриклеточной концентрации кальция, активируется аденилатциклаза, и при отсутствии дополнительного стимула, необходимого для ее угнетения, клетки переходят в рефрактерное состояние. Нарушение в процессе развития рефрактерности может быть одной из причин развития массового тромбоза.

Таким образом, вышеописанный способ количественной оценки перспективен для использования в любых клинико-дигностических тестах, основанных на агглютинации, агрегации, лизисе клеток, преципитации частиц.

Представленный новый метод позволяет оценивать функцию клеток двумя параметрами: ЕС50 и UМАХ, что позволяет количественно характеризовать функциональную активность тромбоцитов и эритроцитов. Данный метод удобен для сопоставления данных из разных серий опытов. Дополнительный графический анализ данных позволяет дать предварительную оценку механизма нарушения клеточного статуса как в условиях эксперимента, так и в клинической практике.