Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Осаждение белков из фосфатного буфера ацетонитрилом и ВЭЖХ-МС >>>

  Ответов в этой теме: 23
  Страница: 1 2 3
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Осаждение белков из фосфатного буфера ацетонитрилом и ВЭЖХ-МС
chern_es
Пользователь
Ранг: 49

05.11.2008 // 17:44:15     
Дорогие коллеги! Поделитесь, пожалуйста, мнениями по следующему вопросу.
Из фосфатного буфера осаждаются белки ацетонитрилом. Пробу выдерживают при -20 градусах 15 минут, после чего отбирают ацетонитрильную часть, а водную (вымороженную) выбрасывают. Что при этом происходит с фосфатами? Попадает ли их часть в ацетонитрил?
Вопрос связан с тем, что полученная ацетонитрильная проба затем колется в ВЭЖХ-МС, а результаты анализа получаются не очень-то обнадеживающими...
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


05.11.2008 // 23:52:49     
Фосфат в позитивной моде по-определению не хорошо и, таки да, какой то бэкграунд присутсвует. Мы вообще стараемся фосфатный буфер не пользовать, если например хлороформные экстракты идут в масс спек. Клетки беред экстракцией, например, лучше промыть в аммониум ацетате или бикарбонате, а потом экстрагировать. Экстракты (хлороформные) моем водой дополнительно, тогда бэкграунд разумный

В вашем случае я бы все же посмотрел сперва в фосфате ли дело? Сделайте контрольную пробу (пусть даже не с тем же содержанием белков, или вообше наведите альбумин до похожей концентрации) из аммониум бикарбоната и посмотрите, будет ли характерная грязь на спектрах.

С фосфатным бэкграундом можно (до некоторой степени) побороться чисто масс спек методами, например усиливая декластеризацию пока целевое вещество тоже не начнет валиться.

Другой вариант увеличить время отмывки на колонке (обращенно-фазовая хроматография?) до того как начать градиент, пропустив так 2-3 мертвых обема колонки.

chern_es
Пользователь
Ранг: 49


06.11.2008 // 10:51:21     
Обойти использование фосфатного буфера нельзя, т.к. это прописано в используемой методике. Исследование представляет собой изучение микросомальной стабильности фарм.препарата - смотрим убыль вещества в результате ферментативной реакции, реакция протекает в фосфатном буфере.
Исключительную важность представляет время анализа. По этой причине удлинение ЖХ-анализа нежелательно.
Другие методы извлечения вещества (ТФЭ, ЖЖЭ) - отметаются из-за большей сложности и длительности.
В методике используется 50мМ фосфатный буфер (рН 7.4), объем конечной смеси - 1 мл. Из этой смеси отбирают 150 мкл и добавляют 300 мкл ацетонитрила для осаждения белков, т.е. разбавляют в 3 раза. Потом выдерживают 20 мин при -20 градусах, вода вымораживается (вопрос: что при этом происходит с фосфатом?), АсN-часть используется для анализа (колем по 50 мкл).
Pavel
Пользователь
Ранг: 81


10.11.2008 // 5:53:07     

chern_es пишет:
Вопрос связан с тем, что полученная ацетонитрильная проба затем колется в ВЭЖХ-МС, а результаты анализа получаются не очень-то обнадеживающими...

В чем, собственно, заключается проблема с результами анализа?
chern_es
Пользователь
Ранг: 49


10.11.2008 // 10:44:59     

Pavel пишет:

В чем, собственно, заключается проблема с результами анализа?


Существенное падение чувствительности в течение нескольких вколов.
Pavel
Пользователь
Ранг: 81


10.11.2008 // 23:00:08     
Я так понимаю, вы все равно делаете короткую хроматографию, поэтому можно отправлять мобильную фазу до выхода пика мимо детектора, исползуя divert valve. Вообще, ничего очень сложного в ТФЭ нет. Загрузить те же самые 1 мЛ образца на картридж, промыть водным раствором и эллюировать 0.5 мЛ ацетонитрила, быстрее чем вымораживать 20 мин. Как вариант, можно делать онлайн ТФЭ. Если метаболит достатожно неполярный, а очень высокой чувствительности не нужно, попробуйте экстрагировать в этилацетат и колоть 1-2 мкЛ на колонку.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Журнал прикладной спектроскопии Журнал прикладной спектроскопии
В журнале публикуются оригинальные статьи и краткие сообщения о результатах научных исследований, обзоры, хроника научной жизни, рецензии на новые книги и научно-техническая информация по прикладной спектроскопии и смежным вопросам.
chern_es
Пользователь
Ранг: 49


05.05.2009 // 13:45:26     
Редактировано 2 раз(а)


Spectrometrist пишет:

В вашем случае я бы все же посмотрел сперва в фосфате ли дело?

С фосфатным бэкграундом можно (до некоторой степени) побороться чисто масс спек методами, например усиливая декластеризацию пока целевое вещество тоже не начнет валиться.

Другой вариант увеличить время отмывки на колонке (обращенно-фазовая хроматография?) до того как начать градиент, пропустив так 2-3 мертвых обема колонки.



Pavel пишет:

Я так понимаю, вы все равно делаете короткую хроматографию, поэтому можно отправлять мобильную фазу до выхода пика мимо детектора, исползуя divert valve. Вообще, ничего очень сложного в ТФЭ нет. Загрузить те же самые 1 мЛ образца на картридж, промыть водным раствором и эллюировать 0.5 мЛ ацетонитрила, быстрее чем вымораживать 20 мин. Как вариант, можно делать онлайн ТФЭ. Если метаболит достатожно неполярный, а очень высокой чувствительности не нужно, попробуйте экстрагировать в этилацетат и колоть 1-2 мкЛ на колонку.

Добрый день! Наша проблема с фосф.буфером была на некоторое время отложена, но теперь снова всплыла. Теперь уже делаем другие опыты, и там тоже нельзя без фосфата (работаем по протоколу равновесного диализа Rapid Equilibrium Dialysis - RED, и в руководстве к используемым нами вставкам для диализа прописано использование именно фосфатного буфера).

Контрольную пробу делали, дело именно в фосфате. Безо всяких реальных матриц, если колоть раствор в фосф.буфере, площадь хроматографического пика падает в 8 раз по сравнению с раствором в ацетонитриле, а высота - в 30 раз (вещество - ранитидин). При этом используем монолитную колонку, MS/MS режим MRM, длина run'a 1,1 мин, сброс потока до попадания в МС до выхода пика целевого вещества организован.

Усиление декластеризации или увеличение времени отмывки в градиенте не помогают. При усилении декластеризации снижается чувствительность, что критично (и так работаем на пределе), а насчет времени отмывки - я работаю в изократике при 20% воды, 80% ацетонитрила с 0.1% муравьинки. При изменении соотношения с 20:80 на 90:10 в начале хроматограммы и работе в градиенте вещество выходит при том же времени удерживания, что и при 20:80, но опять же падает чувствительность, а на влиянии фосфата это никак не сказывается.

ТФЭ пробовали, не помогло.

Помогите, пожалуйста! Что еще можно сделать?
chern_es
Пользователь
Ранг: 49


05.05.2009 // 13:48:04     
Редактировано 2 раз(а)

Данные последних экспериментов:

оказывается, дело не (только) в МС, а в плохой хроматографии.
При вводе 50 мкг/мл ранитидина в ацетонитриле (система ВЭЖХ-УФД-МС/МС) пик, регистрируемый УФД - достаточно узкий, а при 50 мкг/мл ранитидина в фосфатном буфере соотв. пик размазанный, хвостатый, некрасивый.
Колонка Chromolith RP-18e 100x4.6 мм. На другом приборе с другой колонкой (XBridge, С18, 5 мкм, 50х4.6мм) аналогичные проблемы.
Работаем в изократике...

Может быть, колонки такие не подходят?? Я не обладаю столь глубоким опытом в ВЭЖХ, подскажите, пожалуйста, может такое быть?
trozen
Пользователь
Ранг: 216


05.05.2009 // 23:21:10     

chern_es пишет:

Может быть, колонки такие не подходят?? Я не обладаю столь глубоким опытом в ВЭЖХ, подскажите, пожалуйста, может такое быть?


а есть возможность попробовать колонку с нитрильной фазой?
ранитидин весьма полярен с виду..
и еще - это не описка - 80% ацетонитрила и 10% ацетонитрила дают одинаковое время удерживания?
ТС
chern_es
Пользователь
Ранг: 49


06.05.2009 // 0:03:27     
Редактировано 6 раз(а)


trozen пишет:

а есть возможность попробовать колонку с нитрильной фазой?
ранитидин весьма полярен с виду..
и еще - это не описка - 80% ацетонитрила и 10% ацетонитрила дают одинаковое время удерживания?
ТС

Тим, спасибо за идею насчет колонки. Я бы с радостью попробовала другую фазу, но колонки у нас, к сожалению, все на основе С18 - из-за ее универсальности. У нас поток разных соединений - кандидатов в лекарства, подбирать колонку индивидуально возможности нет. Ранитидин в данном случае - модельное соединение, на примере которого я в данный момент отрабатываю методику, которую в ближайшем будущем надо будет применить к полусотне разных соединений.
Да, 80% ацетонитрила и 10% ацетонитрила дают одинаковое время удерживания. Уже не в первый раз я это вижу. Предполагаю, что дело отчасти в высокой скорости потока через монолитную колонку (2.7 мл/мин). Времена удерживания фактически одинаковые, хотя ширина и форма пика несколько зависит от соотношения фаз.
trozen
Пользователь
Ранг: 216


06.05.2009 // 7:48:10     

chern_es пишет:

trozen пишет:
Предполагаю, что дело отчасти в высокой скорости потока через монолитную колонку (2.7 мл/мин). Времена удерживания фактически одинаковые, хотя ширина и форма пика несколько зависит от соотношения фаз.

2,7 мл/мин как-то многовато по-моему для аналитической колонки, хоть у монолитных и малое сопротивление, но эффективность может резко падать.. то, что времена удерживания почти не зависят от состава элюента говорит о том что колонка вообще ведет себя как пустая трубка..
я бы 0,7 мл/мин поставил, ну до 1 мл/мин по-любому
ТС

  Ответов в этой теме: 23
  Страница: 1 2 3
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты