| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Осаждение белков из фосфатного буфера ацетонитрилом и ВЭЖХ-МС >>>
|
 |
| Автор | Тема: Осаждение белков из фосфатного буфера ацетонитрилом и ВЭЖХ-МС | ||
|
chern_es Пользователь Ранг: 49 |
 05.11.2008 // 17:44:15
Дорогие коллеги! Поделитесь, пожалуйста, мнениями по следующему вопросу. Из фосфатного буфера осаждаются белки ацетонитрилом. Пробу выдерживают при -20 градусах 15 минут, после чего отбирают ацетонитрильную часть, а водную (вымороженную) выбрасывают. Что при этом происходит с фосфатами? Попадает ли их часть в ацетонитрил? Вопрос связан с тем, что полученная ацетонитрильная проба затем колется в ВЭЖХ-МС, а результаты анализа получаются не очень-то обнадеживающими... |
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
05.11.2008 // 23:52:49
Фосфат в позитивной моде по-определению не хорошо и, таки да, какой то бэкграунд присутсвует. Мы вообще стараемся фосфатный буфер не пользовать, если например хлороформные экстракты идут в масс спек. Клетки беред экстракцией, например, лучше промыть в аммониум ацетате или бикарбонате, а потом экстрагировать. Экстракты (хлороформные) моем водой дополнительно, тогда бэкграунд разумный В вашем случае я бы все же посмотрел сперва в фосфате ли дело? Сделайте контрольную пробу (пусть даже не с тем же содержанием белков, или вообше наведите альбумин до похожей концентрации) из аммониум бикарбоната и посмотрите, будет ли характерная грязь на спектрах. С фосфатным бэкграундом можно (до некоторой степени) побороться чисто масс спек методами, например усиливая декластеризацию пока целевое вещество тоже не начнет валиться. Другой вариант увеличить время отмывки на колонке (обращенно-фазовая хроматография?) до того как начать градиент, пропустив так 2-3 мертвых обема колонки. |
||
|
chern_es Пользователь Ранг: 49 |
06.11.2008 // 10:51:21
Обойти использование фосфатного буфера нельзя, т.к. это прописано в используемой методике. Исследование представляет собой изучение микросомальной стабильности фарм.препарата - смотрим убыль вещества в результате ферментативной реакции, реакция протекает в фосфатном буфере. Исключительную важность представляет время анализа. По этой причине удлинение ЖХ-анализа нежелательно. Другие методы извлечения вещества (ТФЭ, ЖЖЭ) - отметаются из-за большей сложности и длительности. В методике используется 50мМ фосфатный буфер (рН 7.4), объем конечной смеси - 1 мл. Из этой смеси отбирают 150 мкл и добавляют 300 мкл ацетонитрила для осаждения белков, т.е. разбавляют в 3 раза. Потом выдерживают 20 мин при -20 градусах, вода вымораживается (вопрос: что при этом происходит с фосфатом?), АсN-часть используется для анализа (колем по 50 мкл). |
||
|
Pavel Пользователь Ранг: 81 |
10.11.2008 // 5:53:07
В чем, собственно, заключается проблема с результами анализа? |
||
|
chern_es Пользователь Ранг: 49 |
10.11.2008 // 10:44:59
Существенное падение чувствительности в течение нескольких вколов. |
||
|
Pavel Пользователь Ранг: 81 |
10.11.2008 // 23:00:08
Я так понимаю, вы все равно делаете короткую хроматографию, поэтому можно отправлять мобильную фазу до выхода пика мимо детектора, исползуя divert valve. Вообще, ничего очень сложного в ТФЭ нет. Загрузить те же самые 1 мЛ образца на картридж, промыть водным раствором и эллюировать 0.5 мЛ ацетонитрила, быстрее чем вымораживать 20 мин. Как вариант, можно делать онлайн ТФЭ. Если метаболит достатожно неполярный, а очень высокой чувствительности не нужно, попробуйте экстрагировать в этилацетат и колоть 1-2 мкЛ на колонку. |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
chern_es Пользователь Ранг: 49 |
05.05.2009 // 13:45:26
Редактировано 2 раз(а)
Добрый день! Наша проблема с фосф.буфером была на некоторое время отложена, но теперь снова всплыла. Теперь уже делаем другие опыты, и там тоже нельзя без фосфата (работаем по протоколу равновесного диализа Rapid Equilibrium Dialysis - RED, и в руководстве к используемым нами вставкам для диализа прописано использование именно фосфатного буфера). Контрольную пробу делали, дело именно в фосфате. Безо всяких реальных матриц, если колоть раствор в фосф.буфере, площадь хроматографического пика падает в 8 раз по сравнению с раствором в ацетонитриле, а высота - в 30 раз (вещество - ранитидин). При этом используем монолитную колонку, MS/MS режим MRM, длина run'a 1,1 мин, сброс потока до попадания в МС до выхода пика целевого вещества организован. Усиление декластеризации или увеличение времени отмывки в градиенте не помогают. При усилении декластеризации снижается чувствительность, что критично (и так работаем на пределе), а насчет времени отмывки - я работаю в изократике при 20% воды, 80% ацетонитрила с 0.1% муравьинки. При изменении соотношения с 20:80 на 90:10 в начале хроматограммы и работе в градиенте вещество выходит при том же времени удерживания, что и при 20:80, но опять же падает чувствительность, а на влиянии фосфата это никак не сказывается. ТФЭ пробовали, не помогло. Помогите, пожалуйста! Что еще можно сделать? |
||
|
chern_es Пользователь Ранг: 49 |
05.05.2009 // 13:48:04
Редактировано 2 раз(а) Данные последних экспериментов: оказывается, дело не (только) в МС, а в плохой хроматографии. При вводе 50 мкг/мл ранитидина в ацетонитриле (система ВЭЖХ-УФД-МС/МС) пик, регистрируемый УФД - достаточно узкий, а при 50 мкг/мл ранитидина в фосфатном буфере соотв. пик размазанный, хвостатый, некрасивый. Колонка Chromolith RP-18e 100x4.6 мм. На другом приборе с другой колонкой (XBridge, С18, 5 мкм, 50х4.6мм) аналогичные проблемы. Работаем в изократике... Может быть, колонки такие не подходят?? Я не обладаю столь глубоким опытом в ВЭЖХ, подскажите, пожалуйста, может такое быть? |
||
|
trozen Пользователь Ранг: 216 |
05.05.2009 // 23:21:10
а есть возможность попробовать колонку с нитрильной фазой? ранитидин весьма полярен с виду.. и еще - это не описка - 80% ацетонитрила и 10% ацетонитрила дают одинаковое время удерживания? ТС |
||
|
chern_es Пользователь Ранг: 49 |
06.05.2009 // 0:03:27
Редактировано 6 раз(а) Тим, спасибо за идею насчет колонки. Я бы с радостью попробовала другую фазу, но колонки у нас, к сожалению, все на основе С18 - из-за ее универсальности. У нас поток разных соединений - кандидатов в лекарства, подбирать колонку индивидуально возможности нет. Ранитидин в данном случае - модельное соединение, на примере которого я в данный момент отрабатываю методику, которую в ближайшем будущем надо будет применить к полусотне разных соединений. Да, 80% ацетонитрила и 10% ацетонитрила дают одинаковое время удерживания. Уже не в первый раз я это вижу. Предполагаю, что дело отчасти в высокой скорости потока через монолитную колонку (2.7 мл/мин). Времена удерживания фактически одинаковые, хотя ширина и форма пика несколько зависит от соотношения фаз. |
||
|
trozen Пользователь Ранг: 216 |
06.05.2009 // 7:48:10
2,7 мл/мин как-то многовато по-моему для аналитической колонки, хоть у монолитных и малое сопротивление, но эффективность может резко падать.. то, что времена удерживания почти не зависят от состава элюента говорит о том что колонка вообще ведет себя как пустая трубка.. я бы 0,7 мл/мин поставил, ну до 1 мл/мин по-любому ТС |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 23
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
