Форумы ANCHEM.RU: О сложных взаимоотношениях холестерола и ВЭЖХ

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

О сложных взаимоотношениях холестерола и ВЭЖХ >>>

  Ответов в этой теме: 32
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Artem
Пользователь
Ранг: 193

12.05.2004 // 11:06:56

Dionisii пишет:
Я снова заколол холестерин, немного изменив условия. Пик, кстати, действительно уширен, и к тому же ассимметричен. А что, если органического модификатора добавить, пик станет уже? Я то думал, что наоборот...

Ну, вообщето, да. Элюирующая сила подвижной фазы увеличится. Попробуйте все-таки для улучшения формы пика повысить температуру.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Artem
Пользователь
Ранг: 193

12.05.2004 // 11:10:27

Garry пишет:

Dionisii пишет:
Разделение имело место быть, но качество, к сожалению, оставляет желать лучшего. Пик был растянутый по времени с "мохнатой" вершиной. Кстати, вот еще один злободневный вопрос: отчего появляются пики с "мохнатой" вершиной. Я с такими пиками сталкивался неоднократно, работая с липидами. Вершина пика в увеличенном виде представляет собой частокол маленьких пичков.
Обычно деление верхушки пика происходит по трем причинам:
1. Столбик сорбента в колонке треснул (как правило вверху). Нужно починить колонку - благо это не сложно.
2. В этих условиях наблюдается эксклюзионный механизм деления по Mw.
3. Вытекающее из 2. Пик в-ва неоднороден и имеет полидисперсность.
4. Возможно анализ проходит на предельной концентрации (при ближнем УФ 205-210 нм)поэтому уровень шума больше уровня полезного сигнала. Пик довольно уширен, поэтому на макушке пика и наблюдается частокол шумовой составляющей полезного сигнала. У меня такое наблюдается при анализе декстранов. Приходится сглаживать.

Игорь!
Не думаю, что первая причина может дать шум на вершине пика. Чаще всего при нарушении слоя сорбента наблюдается раздвоение пика, как буд-то происходит не полное деление. А вот причина 4 более вероятна.
Артем

Леонид
VIP Member
Ранг: 5266

12.05.2004 // 11:53:31

Если пик растянут, а k` не превышает 2 (резкое падение эффективности), то либо у Вас в этом пике несколько неразделившихся веществ, либо целевое вещество сорбируется одновременно по нескольким механизмам. В первом случае нужно получше чистить пробу или отстроиться от примесей изменением состава элюента и типа применяемого сорбента, а во втором - выйти в распределительный режим. Для этого попробуйте часть ацетонитрила (до 20%) заменить на изопропанол, поиграйтесь с рН и/или добавьте в элюент до 0,05 - 0,1М любой неорганической соли (хоть поваренной) при одновременном увеличении в элюенте доли органического растворителя.
Есть, правда, и еще одна возможная причина Ваших проблем - убитая или изначально поганая колонка. Тут уж все методические ухищрения помогут мало.

Dionisii
Пользователь
Ранг: 377

12.05.2004 // 13:53:21

Редактировано 2 раз(а)

Леонид пишет:
Если пик растянут, а k` не превышает 2 (резкое падение эффективности), то либо у Вас в этом пике несколько неразделившихся веществ, либо целевое вещество сорбируется одновременно по нескольким механизмам. В первом случае нужно получше чистить пробу или отстроиться от примесей изменением состава элюента и типа применяемого сорбента, а во втором - выйти в распределительный режим. Для этого попробуйте часть ацетонитрила (до 20%) заменить на изопропанол, поиграйтесь с рН и/или добавьте в элюент до 0,05 - 0,1М любой неорганической соли (хоть поваренной) при одновременном увеличении в элюенте доли органического растворителя.
Есть, правда, и еще одна возможная причина Ваших проблем - убитая или изначально поганая колонка. Тут уж все методические ухищрения помогут мало.

Колонка вроде ничего - Luna С18 фирмы Phenomenex, так что, я думаю, причина не в ней. Насчет изопропанола... Мне кажется, что в ближнем УФ он создаст нежелательные шумы и вреда от него будет больше чем пользы. А ваш совет по поводу соли обязательно применю. Кстати, вы не посоветуете, какую соль лучше использовать для этих целей?

Леонид
VIP Member
Ранг: 5266

12.05.2004 // 15:12:04

Изопропанол, если он чистый, в УФ еще более прозрачен, чем ацетонитрил, так что бояться помех при детектировании не стоит. Единственный отрицательный момент - повышение вязкости и соответственно - давления. Но если насос нормальный (не милихромовский

), то и по этому поводу беспокоиться не стоит.
Что касается соли, то можно добавить в принципе любую. Кто что любит и к чему привык. Я предпочитаю фосфатный буфер (дигидрофосфат натрия или калия, иногда, если нужен более кислый рН, - с добавкой фосфорной кислоты). Он совершенно прозрачен в УФ и стабилизирует рН. Недостаток - плохо хранится, поскольку его обожают кушать грибки и бактерии. Кое кто любит перхлораты лития и аммония. Они более хорошо растворимы в водно-органических элюентах, а значит - меньше вероятность что элюент под действием соли расслоится или соль из него выпадет. Кроме того, бактерии его не любят.
Ну это все значимо при анализе полярных веществ, а в рассматриваемом случае можно попробовать применить практически любую соль, растворы которой прозрачны в УФ. Я бы взял перхлорат аммония, так как применяемые элюенты слишком уж мало содержат воды.
Основная роль соли при этом - понизить растворимость сорбата в элюенте за счет эффекта высаливания и изменить его удерживание на поверхности сорбента таким образом, чтобы можно было применить более сильные элюенты и как бы "сфокусировать" пик вещества, не дать ему хвостатиться и размываться.
В действительности там происходят гораздо более сложные процессы, в том числе и подавляющие деление по эксклюзионному механизму.
Я не знаю, что там за матрица, но может этот прием как раз и сработает.

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Всероссийское масс-спектрометрическое общество (ВМСО)
Общественная организация, объединяющая на добровольных началах ученых и специалистов, занятых научно-исследовательской, производственной и преподавательской работой в области масс-спектрометрии и ее приложений, а также всех людей интересующихся этим методом.

Garry
VIP Member
Ранг: 1076

12.05.2004 // 15:32:51

Дионисий ! Вот ссылка на книгу из которой взята метода для стеринов. Э.Хефтман "Хроматография" Практическое приложение метода. М."Мир". 1986 г. в 2-х томах.
Что касается замечаний Артема, то я согласен. Нужно повысить содержание ацетонитрила или повысить температуру прежде чем добавлять соли по рекомендации Леонида. Просто я в свое время анализировал содержание бета-каротина в биомассе и в экстрактах из нее. И на этот самый бета-каротин (хотя это не холестерин) никакие добавки солей не действовали. Не советую в водных растворах ацетонитрил (или его часть)заменять изо-пропанолом, так как при этом очень сильно возрастает вязкость элюента и ничего хорошего кроме значительного повышения давления на входе Вы не получите. А при этом эффективность разделения еще упадет !

Леонид
VIP Member
Ранг: 5266

12.05.2004 // 15:47:52

Редактировано 1 раз(а)

Ну что ж...Мнения разделились.

Я не буду настаивать на своих советах. Просто в некоторых случаях мне в мою бытность удалось этими приемами добиться улучшения разделения и формы пиков похожих соединений (стероидных гормонов).
Допускаю, что в данном конкретном случае это может и не сработать, но попробовать то можно...

КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306

12.05.2004 // 16:29:44

Редактировано 1 раз(а)

А Дионисий-то прав... (Кстати, здорово!

)

Если органики прибавить- пик уширится.
Никакой мистики здесь нет - С18 фаза "разжижается" на таких элюентах, и теряет эффективность и разрешающую способность. Для таких анализов специально разработана фаза С30. Вот тут и температурку до градусов 40 поднять можно, и вообще...

Опять же - уменьшить содержание модификатора нельзя - все посыпется в осадочек.

И еще - блин ну извращение это - делать липиды на УФ, любая фигушка накроет все ... И маусимум у одинарной связи двойной 180 нм. Как, впрочем, и у гидроксила. А чем рефактометр хороший плох?

Мохнатость - это скорее всего жирными образцами загадилось стеклышко в кювете. Например.

Dionisii
Пользователь
Ранг: 377

13.05.2004 // 9:15:29

Редактировано 3 раз(а)

Здорово, Костя!

Спасибо, что почтил своим вниманием мой топик. Как видишь по прежнему занимаюсь такой извращенческой темой, как ВЭЖХ липидов. Надеюсь уже летом буду в Москве и навсегда забуду весь этот маразм. Думаю заняться наукой. Кстати, как нибудь можно будет пивчанского погонять... Рефрактометр хороший плох тем, что он хорош, лишь когда концентрация вещества большая - только в этом случае можно получить презентабельный пик, а концентрат этой жирной параши подавать на обращенку я боюсь. Мне кажется эту муть раза два заколешь - и колонку можно смело выкидывать. То что ты сказал насчет стеклышка в кювете меня весьма пугает, может быть придется
сервис-инженера вызывать!

КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306

13.05.2004 // 14:58:03

Э,э, да не пугайся ты так, я сказал первое что взбрело в голову!

Это может быть все что угодно, глюк "испытанный". Вариантов и правда много. Попробуй такой фокус - перед пиком еще разок пересбрось вычитание фона! Посмотрим что выйдет.
Да, от концентрата все подохнет.
Нужна С30, она хоть как-то может исправить ситуацию. Стоит конечно, много, рублей 500 а то и все 700.
Пивчанского погоняем, запросто.
Куда устроился?
Летом - это в августе?


Ответов в этой теме: 32 Страница: 1 2 3 4 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты