Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Проблема с ВЭЖХ колонкой после использования ТБАБ >>>

  Ответов в этой теме: 14
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Проблема с ВЭЖХ колонкой после использования ТБАБ
Partos
Пользователь
Ранг: 37

12.08.2022 // 16:03:11     
Редактировано 1 раз(а)

Добрый день! Прошу отнестись с пониманием, осваиваю прибор один, опыта нет, приходится учиться на своих ошибках..

Возникла проблема с методикой определения фосфотиамина, а точнее с быстрым выходом из строя колонки. В составе подвижной фазы в качестве модификатора используется тетрабутиламмония бромид. Как я понял из прочитанного, быстрая деградация колонки при использовании довольно агрессивных модификаторов это нормально, пишут про в среднем от 200 до 500 вколов до появления первых признаков асимметрии. Но у меня ухудшение хроматограмм началась практически сразу. На первых тестовых хроматограммах ассиметрия пика фосфотиамина была на уровне 1,1-1,2 и время выхода в районе 3,3 мин, всё хорошо. Потом буквально сразу пики поплыли и через 3 месяца нечастых анализов (всего примерно 100 вколов) ассиметрия более 1,8, время выхода 5,6. Давление на колонке за это время упало с 18,5 МПа до 16,3 МПа при одинаковых условиях.

Колонка изначально была новая, с другими фазами не использовалась. После серии вколов сразу же промываю водой или 10% ацетонитрилом минимум час, затем заполняю 60-80% ацетонитрилом и так оставляю (с буферами никогда не оставляю даже на ночь). Перед началом работы пропускаю несколько объемов воды и кондиционирую подвижной фазой также минимум час. Анализ провожу строго в соответствии с методикой, для самодеятельности не хватает опыта.

Описание методики:
- подвижная фаза - смесь калия фосфата однозамещенного раствора 0,01М, содержащая тетрабутиламмония бромид (0,006 моль/л), доведенная до pH 6,8 натрия гидроксида раствором 1 М и метанола (1000:80 по объему).
- колонка Chromasil C18 50 x 4.0mm 5μm или аналогичная
(используется NUCLEODUR C18 ec 100Å 150 x 4.0mm 5μm)
- скорость потока 1,1-1,4
- изократика
- детектор УФ 265 нм
- объем пробы 10 мкл

Собственно вопросы:
1. Почему так быстро могла выйти из строя колонка? Слишком много ТБАБ? Хронический перегруз колонки? Но всё по методике. Или она просто наконец-то вышла на режим, то есть такие пики это ее нормальное состояние. Но это странно, изначально лучше.
2. Чем можно попробовать отмыть? Пока пробовал ацетонитрилом разных концентраций, безуспешно. По рекомендациям с этого форума собираюсь попробовать 40% вода с фосфорной кислотой до pH 3,0 + метанол 60%
3. Я в принципе что-то делаю не так? Хотя, судя по спецификациям, эта колонка достаточно живучая, "робастная" и при моих условиях вообще не должна напрягаться.
4. Не может ли это быть следствием механического повреждение сорбента? Серию вколов ставлю обычно на ночь, за смену не успеваю, колонка находится под давлением более 16 часов подряд.
5. Вряд ли, но не может ли это быть следствием износа уплотнителей насосов? Отходили полтора своих ресурса, но так как пульсации в норме, не вижу смысла пока менять. Тем более месяц назад делал поверку прибора, всё идеально на антрацене в ацетонитриле.
6. Как работать в будущем с этой методикой, если эту колонку восстановить не удастся?

При необходимости могу прислать скриншоты хроматограмм.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
OldBrave
VIP Member
Ранг: 1253


12.08.2022 // 17:06:38     
Редактировано 3 раз(а)


Partos пишет:
...Но у меня ухудшение хроматограмм началась практически сразу. На первых тестовых хроматограммах ассиметрия пика фосфотиамина была на уровне 1,1-1,2 и время выхода в районе 3,3 мин, всё хорошо. Потом буквально сразу пики поплыли и через 3 месяца нечастых анализов (всего примерно 100 вколов) ассиметрия более 1,8, время выхода 5,6. Давление на колонке за это время упало с 18,5 МПа до 16,3 МПа при одинаковых условиях.
Колонка изначально была новая...
5. Вряд ли, но не может ли это быть следствием износа уплотнителей насосов? Отходили полтора своих ресурса, но так как пульсации в норме, не вижу смысла пока менять. Тем более месяц назад делал поверку прибора, всё идеально на антрацене в ацетонитриле...

Похоже, что с колонкой у Вас все нормально. Снижение рабочего давления в отсутствие течи указывает на неисправность клапанов в насосе. Промойте клапана или их замените. Эта неисправность может не проявляться до определенного давления. Для проверки заглушите выход из насоса и запустите его с небольшим расходом (~0,2 мл/мин). Убедитесь, что давление выше 16,3 МПа он просто не может дать...
voodensky
Пользователь
Ранг: 500


14.08.2022 // 10:36:21     
1. Было бы неплохо посмотреть хроматограммы
2. Время выхода увеличилось, значит либо колонка лучше модифицировалась, либо утечка. По утечки см. предыдущее сообщение. По модификации - ионпарники могут долго уравновешиваться.
Если пики хвостят, значит есть дополнительное взаимодействие, может быть система не до конца уравновесилась.
Почему после анализа промываете колонку водой? Колонки С18 чистой водой не промываются.
Partos
Пользователь
Ранг: 37


15.08.2022 // 9:45:46     
Редактировано 1 раз(а)


OldBrave

voodensky
Скриншоты хроматограмм залил по ссылке:
https://cloud.mail.ru/public/wVxk/GQqpzfFWc

Там для примера стандартный раствор и раствор для проверки пригодности системы в самом начале использования колонки и сейчас, с разницей в 3 месяца и порядка 100 вколов. Если честно, я до этого их в лоб не сравнивал, я в шоке от таких изменений. Пока спасало то, что по площадям пиков воспроизводимость анализа нормальная, получаются ожидаемые цифры, и плюс в условиях пригодности системы отсутствует ассиметрия пиков, возможно неспроста. Небольшие изменения характера пульсации насосов (там синей линией на хроматограммах) это скорее всего нормально, возможно какой-то из растворов был хуже дегазирован и плюс разное давление в системе. А вот почему давление разное нужно выяснять Всё таки для начала поменяю уплотнители насосов, а там буду думать дальше. Возможно проблема действительно частично из-за этого, совпало так.
Докинул еще хроматограммы для поверки, антрацен в ацетонитриле, две серии по шесть вколов с разницей в 4 часа, месяц назад делал, там всё отлично по воспроизводимости. Но там и давление небольшое, 7,5 МПа, возможно утечка не проявляется.

По поводу промывки водой, прочитал в инструкции к прибору... Написано, переходить с буферов на другие фазы нужно через воду (пруф там же по ссылке). Мне показалось это логичным, так и делал. Возможно там речь только про линии прибора, но отключать колонку каждый раз перед промывкой это ерунда какая-то. Тогда лучше чем, 10% ацетонитрилом? От недостатка опыта и знаний все проблемы, хорошо хоть такие форумы есть.
voodensky
Пользователь
Ранг: 500


15.08.2022 // 11:03:38     
1. Относительно воды. У вас фосфатный буфер, фосфаты хорошо смешиваются с водой и ацетонитрилом, промывать через воду смысла нет, особенно если вы не отключаете колонку. Указанная процедура применяется при несмешивающих фазах. Например, вы промываете систему с 80% ацетонитрилом, а потом используете сульфатный буфер. В этом случае, если что-то недосмотрели, сульфат может выпасть в осадок и забить систему. Нужно отключить колонку и промыть систему водой, потом ПФ с сульфатом, потом подключить колонку. Я бы после анализа промывал бы тем раствором, в котором консервировал бы. Т.е. если вы консервируете в 80% ацетонитриле, я бы после анализа постепенно перешел бы на 80% ацетонитрил и промывал бы 30 мин. Т.е. 20 мин в вода/ацетонитрил 20%, 20 мин вода - 50%, 30 мин - 80% и на консервацию.
2. Относительно поверки. Там очень большие сигналы и ассиметричность, которую вы видите на пробах, можно не увидеть. Но это показатель того, что система работает, механических повреждений колонки нет.
3. Та ассиметрия, которую вы видите, может быт связана с наличием нескольких механизмов сорбции. А их будет обязательно несколько, так как у вас сорбция на чистом сорбенте и на модифицированном ионпартиком. Вначале, когда у вас была плохая модификация, преобладал механизм сорбции на чистом сорбенте, поэтому ассиметрии не было. Потом когда пошла модификация добавился второй механизм, появилась ассиметрия. Возможно она никуда и не денется. Это из моего представления. на ионпарниках у меня часто ассиметрия значительно хуже.
4. С давлением действительно что-то не то. нужно решить.
Partos
Пользователь
Ранг: 37


15.08.2022 // 11:17:10     
Редактировано 3 раз(а)


voodensky
Спасибо, очень ценные советы, учту.

Забыл отметить, поверка делалась на другой колонке, но попробовать что-то простое на этой хорошая идея.

Еще нашел вот что, цитата из статьи "Динамическое модифицирование в практике ВЭЖХ" Леонид В. Сапрыкин:

"Немаловажным фактором при ДМ является выбор концентрации модифицирующего агента. В некоторой области концентраций изменение свойств хроматографической системы происходит пропорционально количеству присутствующего в элюенте модификатора. Однако, начиная с некоторой концентрации, происходит довольно резкое качественное изменение воздействия модификатора на систему. Это справедливо практически для всех видов ДМ.
Так, например, повышение содержания в элюенте ПАВ при реализации ион-парного механизма ОФ ВЭЖХ до уровня критической концентрации мицеллообразования (ККМ) (для разных ПАВ 0,005 - 0,1 М) и выше, выводит хроматографическое разделение в мицеллярный режим, который, в отличие от ион-парного, характеризуется значительным падением удерживания ионогенных соединений в колонке и уменьшением емкости сорбента к этим веществам [3]. Неионогенные вещества при этом также значительно меняют свое хроматографическое поведение."

Возможно авторы методики подразумевали, что модификатор будет отмываться после каждого использования, а не накапливаться. В этом случае по идее в начале следующей серии опять должны быть нормальные пики, как оно было. Не знаю..
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Камера пробоподготовки водных сред ФК-12М Камера пробоподготовки водных сред ФК-12М
Фотолизная камера ФК-12М предназначена для экспрессной пробоподготовки водных сред при проведении серийных лабораторных определений элементов различными методами, в частности, вольтамперометрическим.
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
voodensky
Пользователь
Ранг: 500


15.08.2022 // 11:56:58     
Сугубо мое лично мнение.
С ионпарником работать тяжело. У вас изократическое элюирование с высоким содержанием водной фазы. Вся грязь (из воды, из ионпарника) будет сорбироваться на колонке. Фактически во время анализа вы играете в перегонки. С одной стороны должно пройти время, чтобы уравновесился ионпарник, с другой стороны - за это время сорбируется грязь, которая мешает анализу. Чем чище реактивы, тем дольше можно проводить анализ без чистки колонки. Бывало и такое, что анализировать не успеваешь.
OldBrave
VIP Member
Ранг: 1253


15.08.2022 // 20:08:16     
Редактировано 2 раз(а)

Для ион-парной хроматографии с ТБАБ всегда использую выделенную колонку. Смысла перед использованием отдельно промывать водой не вижу. На "хвостатость" сильное влияние оказывает рН. Уменьшите рН до 4.0 и замените MeOH на ACN и будет Вам счастье...
OldBrave
VIP Member
Ранг: 1253


17.08.2022 // 19:21:46     
Содержание ТБАБ в элюенте можно смело уменьшить в 4 раза...
valerra
Пользователь
Ранг: 139


19.08.2022 // 9:40:15     
Редактировано 1 раз(а)

При появлении хвостатости я бы для начала перебрал все линии прибора, заменил бы каппиляры и фиттинги, правильно бы их стянул, что бы исключить карманы по ходу потока.

Шаг второй - убедился бы в том, что я работаю на правильной колонке, т.е. на колонке той торговой марки, которая рекомендуется ГОСТ-ом, EDQM или USP. Nucleodur любят покупать, поскольку она обычно немного дешевле других брендов, но в ней носитель не силикагель, а оксид кремния. Она слишком активная поверхностью сорбента, которая может самопроизвольно меняться в ходе анализа. Если для анализа важна кислородная активность носителя, лучше взять колонку в прививке фазы которой содержится кислород (такие как Zorbax-AQ, Symetry-Shild).

Далее, колонка обслуживается не правильно. Некоторые колонки выдерживают промывку водой без последствий, это Zorbax, Extend, Symetry, Luna. А некоторые схлопываются, коллапсируют, такие как Poroshell, Hypersil. Их можно попытаться реанимировать промывая на маленьком потоке 100% ацетонитрила при температуре градусов 50, но полностью они в своё допромывочное состояние так и не возвращаются. По умолчанию, колонки водой мыть нельзя, всегда нужно добавлять хотя бы 5% ацетонитрила.

Четвёртый шаг - я бы начал искать источник грязи, убивающей колонку. Например, у меня были методики, в которой грязью оказались следы моющего средства, которые оставались на внутренней поверхности виал для водвижной фазы. Приходилось делать в документах указания - промывать посуду перед использовнием водой, метанолом, опять водой и сушить избегая попадания катионно-активных ПАВ.

Ну и в целом, это один из самых тяжёлых случаев в ВЭЖХ, когда колонка самопроизвольно меняет свойства. Иногда я и месяц только этой проблемой занимался, покуда не решал проблему. Не очевидная это проблема.
SergeyK
Пользователь
Ранг: 2157


19.08.2022 // 15:41:14     

valerra пишет:
в ней носитель не силикагель, а оксид кремния.
А силикагель - это не оксид кремния? А што тогда?
Может он там просто старый Type A Silica Gel, с железом, алюминием и другими металлами? Потому что фаза старая
mz-at.de/en/chromatography/liquid-chromatography/filling-materials/silica-columns/#:~:text=The%20so%2Dcalled%20Type%2DA,some%20cases%20insufficient%20separation%20performance.

  Ответов в этой теме: 14
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты