| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Влияние ЭДТА в плазме на ВЭЖХ >>>
|
 |
| Автор | Тема: Влияние ЭДТА в плазме на ВЭЖХ | ||
|
AnalystER Пользователь Ранг: 6 |
 10.11.2013 // 16:51:31
Прошу внимания уважаемых химиков-аналитиков. В ходе разработки ВЭЖХ-МС-МС метода для определения субстанции лек.препарата возникла следующая проблема - где-то после 8-го вкола экстракта в колонку происходит увеличение площади пика дейтерированного внутреннего стандарта примерно на 50-70%. При этом у пика немного увеличивается хвостатость и появляется небольшое уширение пика справа у основания. В течение следующих 10 вколов интенсивность и площадь пика не сильно изменяется(хотя что в первых 8-ми образцах, что в последующих 10-ти концентрация внутреннего стандарта одинаковая). Потом колю чистый метанол для проверки контаминации и вижу пик внутреннего стандарта в достаточно большом количестве(до 50% от площади образца), который потом постепенно сходит(в 10 раз за 7 вколов чистого метанола).Пик уширенный и слегла асимметричный. Потом регенерирую колонку 20 минут на чистой органике, и картина повторяется 1 в 1. Что странно, сам аналит не концентрируется и не выходит бланковом вколе, хотя его концентрация в образцах схожа с дейтерированным внутренним стандартом. Что интересно, картина всегда схожая, увеличение площади пика внутреннего стандарта после 8-го вкола эктракта каждый раз после регенерации колонки. И еще: если после серии образцов не проводить короткую регенерацию, а тупо проколоть несколько метанольных бланков, то при вколе реального образца интенсивность пика раз в 5-10 меньше, чем в начале серии. Состав подвижной фазы: В- метанол-ацетонитрил 1-1. А- водный раствор 0.1% муравьиной кислоты и 5mM ацетата аммония. Объем вкола - 5 мкл Колонка prontosil C-18 75 мм, около 8000-9000 теоретических тарелок. Профиль метода: изократический режим 80:20 органика-буфер. Вообще оптимальный изократический метод для субстанции(симметричный пик) - 65 органики и 35 воды, но из-за кумуляции субстанции внутреннего стандарта я увеличил долю органики до 80%, время выхода не изменилось, форма пика приобрела очень незначительную хвостатость, не влияющую на определение низких концентраций. (я думал, что увеличение органики и является ключом к решению проблемы, но оказалось, что нет). Теперь о названии темы - сия картина проявилась на плазме с добавлением K3 ЭДТА. Экстракция - жидкость-жидкостная в этилацетат с последующим упариванием и разбавлением в метаноле. Буфер, который добавляется к плазме в начале экстракции - 0.05% муравьиной кислоты и 20mM ацетата аммония. В итоге прошу дать совет, если кто сталкивался с подобным, и ответить, может ли эдта в плазме давать такую картину из-за его связывания с силикагелем. Для проверки приготовил метанольные растворы аналита и дейтерированного внутреннего стандарта в разном соотношении(концентрация IS всегда одинаковая). Не происходит кумулирования ни внутреннего стандарта, ни аналита. Площади внутреннего стандарта схожи, будь-то 10 вколов или 40. |
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
ATem Пользователь Ранг: 655 |
10.11.2013 // 16:58:07
Я так понимаю, carry over высокий исключается? |
||
|
AnalystER Пользователь Ранг: 6 |
10.11.2013 // 17:00:27
На метаноле кэрри овер меньше 20% от LLOQ. Конечно случается, что иногда превышается 20%, но когда у тебя в образце площадь 100000 у внутреннего стандарта, а в следующим за ним бланке метанольном 50000, то тут уже задумываешься. И такое только на плазме. |
||
|
Ovchar Пользователь Ранг: 16 |
10.11.2013 // 17:18:23
Редактировано 2 раз(а) Так как Вы увеличили долю органики, а время удерживания сохранилось неизменным, я подозреваю, что вещество просто не удерживается. Посчитайте k (удерживание), может просто нет разделения. Вы используете кран-переключатель для отсечения ненужной фракции от ионного источника? Он встроен во все приборы. Я слышал, что антикоагулянт (эдта, гепарин) нужно согласовывать с клиникой и валидировать, это влияет. |
||
|
AnalystER Пользователь Ранг: 6 |
10.11.2013 // 17:52:37
Нет, я не отсекаю фракцию, сам риодайновский кран на детекторе может загрязняться, а так как у меня машина нижнего пикограммового диапазона, видит любую грязь. Рассчет фактора удерживания я не проводил. Как я понимаю, для его расчета нужно определить мертвое время с помощью несорбируемого вещества, и это можно легко сделать с помощью УФ-детектора. На массе у меня нет опыта такой работы и нет сейчас уф-детектора. Если бы вы могли по-подробнее рассказать про эдта и какие у него особенности, я был бы рад. |
||
|
Ovchar Пользователь Ранг: 16 |
10.11.2013 // 19:15:53
Редактировано 2 раз(а) 1. Можно просто вычислить мертвое время. (Длина колонки помноженная на радиус в квадрате на 3.14 (Пи))0.67 делённое на поток. Например колонка 75 мм на 2.1 мм поток 350 мкл/мин. Время будет примерно 75*1.05*1.05*3.14*0.67/350= 0,49 минуты или 30 сек. Если длинный капилляр, большая петля, и предколонка то будет немного больше например 35-40 секунд. Для вещества при таком потоке и колонке я бы подобрал соотношение при котором время удеживания состовляет 2 минуты. Судя по всему интерференция только с внутренним стандартом, то-есть изобарная примесь в плазме есть. 2. Что эдта может влиять слышал на конференции именно в таком контексте. Антикоагулянт для клиники должна назначать аналитическая лаборатория после валидации метода. |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
AnalystER Пользователь Ранг: 6 |
10.11.2013 // 19:28:46
Редактировано 2 раз(а) Спасибо за ответ! Можно узнать, можно ли добиться оптимизации хроматографии другим методом, нежели увеличением времени до 2х минут. Я работаю в изократике, выход у меня где-то на 30й секунде, метод можно делать 1 минуту. В итоге можно сделать больше анализов за рабочий день. |
||
|
Ovchar Пользователь Ранг: 16 |
10.11.2013 // 21:04:16
Редактировано 2 раз(а) А зачем Вам так быстро? Если Вы экстрагируете, то лаборант все равно больше 100 анализов в смену не подготовит. 2 минуты - хорошее время. Можно взять колонку 30 или 50 мм, увеличить поток и уложиться в минуту. Для ориентира, проведите анализ без мсмс просто мс по всему масс диапазону, увидите как выходят эндогенные вещества плазмы. И подбирайте органики столько чтобы вещество выходило сразу после них. Но у меня, например, цикл укола 45 секунд и метод 4 минуты. Этого достаточно, чтобы лаборант полностью был занят весь день, а на ночь в автосамплере остаётся 140 образцов. Узкое место не в приборе. Может у вас робот  ? Кран, кстати, рекомендую задействовать, если вам придётся чистить источник посреди исследования - отклик может сильно измениться.
|
||
|
AnalystER Пользователь Ранг: 6 |
10.11.2013 // 21:48:39
Спасибо за совет по поводу сканирования в режиме мс. Но вот мучает меня вопрос о самой причине сего явления. Читал, что эдта может связываться с силикагелем и размывать хроматографическую зону. Действительно ли это так и можно ли путем изменения pH элюента избавиться от данного явления... |
||
|
Ovchar Пользователь Ранг: 16 |
10.11.2013 // 22:00:48
Редактировано 2 раз(а) Изменение pH может изменить вам как удерживание так и чувствительность, его тоже стоит подобрать правильно. Насчёт эдта помочь не могу. Не изучал этот вопрос детально. Если она имеет широкий пик и вещество выходит под ней то влияние может быть, но думаю это не частое явление и при отработке методики это отслеживается. Отпишитесь потом в тему помогло или нет. |
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2134 |
11.11.2013 // 10:14:33
Редактировано 5 раз(а) 1. ЭДТА здесь ни при чем. Скорее всего, это компоненты матрицы объекта. Думаю то, что выходит после реальных/модельных проб при вколе метанола - это не ВС/IS, а что-то другое. 2. А вот методика кривая - надо оптимизировать. Во-первых, после упаривания ЭА растворяйте сухой остаток в элюенте, во-вторых - подумайте о ТФЭ/SPE, если никак, тогда подумайте о замене ЭА на что-нибудь другое, в-третьих - подумайте о составе промывочной жидкости инжектора и методике промывки, ну и надо поработать над хроматографией (изменить время удерживания, точнее, его добиться) и над МС (можно попробовать подобрать другой MRM переход и/или добавить 1-2 MRM перехода для качественного анализа, если QqLIT, то, конечно, надо не МRM переходы добавлять, а снимать в LIT режиме дополнительно МС/МС-спектр с прекурсора/product ion scan/daughter ion scan). Да и кран в данной ситуации нужно юзать обязательно. |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
