Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Изменение времени удерживания на разных ВЭЖХ колонках одной марки >>>

  Ответов в этой теме: 33
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Изменение времени удерживания на разных ВЭЖХ колонках одной марки
optima
Пользователь
Ранг: 288

23.11.2011 // 13:12:09     
Подскажите пожалуйста, в чем может быть проблема.
Для анализа использовали гель-фильтрационную колонку. Смотрели чистоту белка. В смесь входит как вспомогательное вещество аминокислота. Как положено, белок всегда выходил раньше, аминокислота позже.Элюент - смесь фосфатного буфера и изопропанола.
Купили такую же новую колонку.
С тем же элюентом теперь аминокислота выходит раньше белка!
Как такое может быть?
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


23.11.2011 // 23:39:15     

optima пишет:
Подскажите пожалуйста, в чем может быть проблема.
Для анализа использовали гель-фильтрационную колонку. Смотрели чистоту белка. В смесь входит как вспомогательное вещество аминокислота. Как положено, белок всегда выходил раньше, аминокислота позже.Элюент - смесь фосфатного буфера и изопропанола.
Купили такую же новую колонку.
С тем же элюентом теперь аминокислота выходит раньше белка!
Как такое может быть?

давайте все: картинки, условия (элюент, температура, скорость), колонку, габариты, химию ее фазы.. желательно привести и последовательность эксперимента.. как установили что точно тот самый белок и что это та самая кислота? сравнили ли градуировку по стандартам на старой и новой колонках? и что такого произошло со старой?
optima
Пользователь
Ранг: 288


24.11.2011 // 12:50:42     
Редактировано 1 раз(а)

Уважаемый Константин,
Спасибо, что откликнулись.
Извините за излишнюю лапидарность в вопросе.
Колонка Zorbax GF-250, гидрофильная. Делит белки от 4 000 до 400 000 Да.
Исследуемая аминокислота – глицин, мол.м. 75 Да.
Исследуемый белок около 22 000 Да.
При использовании 0.025 М фосфатного буфера в смеси с изопропанолом белок вышел позже глицина, а при использовании 0.063 М фосфатного буфера+изопропанол белок вышел раньше глицина.
Глицин вышел в одно и то же время.
Кололи отдельно смесь белка и глицина, глицин, белок, буфер для разведения.
Получается, колонка просто „не видит” глицин? Он для нее слишком мелкий?

На старой колонке стало невозможно добиться критерия приемлемости – димеры от мономера слишком плохо отделялись. Но ней и при 0.025 М буфере белок выходил раньше глицина, не говоря уже о 0.063 М.

Каюсь, колонку не калибровали – просто работали по фармакопейному методу, все вроде получалось.((
Волгин
VIP Member
Ранг: 1282


24.11.2011 // 14:55:38     

optima пишет:
...белок вышел позже глицина, ... белок вышел раньше глицина.
Глицин вышел в одно и то же время.
Получается, колонка просто „не видит” глицин? Он для нее слишком мелкий?

1. ??? Как это - не видит???
2. Если Вы не перегружаете колонку белком (или образцом), то Ваш белок, независимо от его геометрической формы (единственно на которую может повлиять изменение концентрации буфера - при прочих равных условиях) просто обязан выходить раньше глицина. На нормально работающей колонке. Следовательно, у Вас происходит адсорбция белка на каких-то активных центрах сорбента, которых быть не должно.
Что это - гидроксилы, ионы тяжелых металлов или что-то еще - разбираться не будем.
3. Для проверки этого предположения советую провести тест колонки, который был приложен в паспорте на нее. Если он совпадет с приложенным, тогда придется ломать голову. Если же нет, и у Вас есть доказательства, что Вы сами эту колонку не угробили, можете попробовать повоевать с поставщиком.
4. Если такого желания нет, можно попробовать старый "дедовский" метод улучшения колонки. Прокачайте через нее огромный избыток раствора какого-нибудь пролезающего в поры белка, например бычьего сывороточного альбумина - он, возможно, забьет активные центры (возможно и не забьет...). Далее отмываете от него Вашим элюентом и работаете.
PS Да, перед тем как гонять через колонку альбумин можно еще попробовать помыть ее раствором ЭДТА - на случай, если на нее все-таки сели тяжелые металлы, например железо, например из воды элюента. Воду Вы, надеюсь, контролируете?
optima
Пользователь
Ранг: 288


24.11.2011 // 15:03:35     
Редактировано 1 раз(а)

Спасибо большое за ответ.
То есть, все-таки похоже на проблемы с колонкой?
Тестового набора как в паспорте увы нету...
Вода у нас Milli Q, обратный осмос. Контролируем по фармакопейным параметрам.
Спасибо еще раз. Будем думать...

Вариант с БСА, если честно, не очень понятен. Но как я понимаю, это крайние меры?
virtu
VIP Member
Ранг: 2121


24.11.2011 // 17:11:45     
1. Все перепроверьте, возможно, банальные ошибки (кондиционирование, состав элюента и т.д.).

2. Сравните паспорта колонок. Сорбент не явл. константой, от партии к партии его физ.-хим. свойства меняются, т.е. в пределах "окна", которое определяется технологией производства, контролем качества и т.д.

3. Если в фармстатье прописан 0,063М (если не ошибаюсь, то так и есть) фосфатный буфер и с ним все ОК на новой колонке, то работайте на нем и не заморачивайтесь.

4. Не рекомендую, сейчас, следовать советам ув. Волгина ( ) на предмет ЭДТА, БСА и т.д. Все верно, только всему свое время.

5. Нужно тестирование (в соотв. с паспортом), чтобы выявить брак. Брак маловероятен.
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
Жидкостной хроматограф Альфахром Жидкостной хроматограф Альфахром
Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-спектрофотометрическим детектором. Одновременное детектирование на 8 длинах волн. Поставляется с Базой Данных ВЭЖХ-УФ.
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
optima
Пользователь
Ранг: 288


24.11.2011 // 17:15:14     
Редактировано 1 раз(а)

Спасибо за ответ.
Кондиционирование - это что?
Дело в том, что такое поведение в принципе противоречит смыслу гель-фильтрации - тот, кто крупнее выходит раньше, кто мельче - позже. А тут все наоборот получается.

В фармакопее действительно 0,063 М.))))
Но на в таком варианте на новой колонке все вышло практически одновременно - белок и глицин почти не разделились, белок совсем чуть-чуть раньше вышел. То, что это два пика, я поняла, проколов отдельно белок и глицин.((((
Волгин
VIP Member
Ранг: 1282


24.11.2011 // 17:18:09     
Редактировано 1 раз(а)


optima пишет:
...Вариант с БСА, если честно, не очень понятен. Но как я понимаю, это крайние меры?
1. Конечно крайние! И с ЭДТА - тоже.
2. "Рекомендую сейчас следовать советам ув." virtu!
optima
Пользователь
Ранг: 288


24.11.2011 // 17:24:58     
Редактировано 3 раз(а)


Волгин пишет:

optima пишет:
...Вариант с БСА, если честно, не очень понятен. Но как я понимаю, это крайние меры?
1. Конечно крайние! И с ЭДТА - тоже.
2. "Рекомендую сейчас следовать советам ув." virtu!

КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


24.11.2011 // 18:19:24     
Так, все-таки умудрились не указать соотношение изопропанола и буфера!!!

Вобщем все с этим случаем ясно. Сначала - туториал. Это диольная колонка. Она работает при разделении белков в смешанном режиме: смеси эксклюзии (гель-фильтрации) и адсорбции в режиме HILIC (гидрофильная хроматография). От адсорбата и состава элюента зависит - кто из них пересилит.

Чем больше в молекуле полярных групп - тем сильнее ее удерживание по гидрофильному механизму. Удерживание также растет при уменьшении доли воды (буфера) в элюенте и при уменьшении кол-ва соли в буфере.

Чем молекула просто больше - тем сильнее ее эксклюзия.

Есть нулевое время (нулевой объем). Там выходит все, что НЕ эксклюдируется (то есть заходит во все поры) и НЕ удерживается. Предположим, что глицин как раз выходит в нуле (поскольку от смены условий он никуда не сдвигается). Теперь следите - если белок НЕ удерживается, то он выходит раньше нулевого (и раньше глицина) - потому что он только эксклюдируется (заходит не во все поры, а только большие). Но что случится, если он вдруг начнет удерживаться? Он поползет вправо, постепенно "догонит" лейцин, а потом и "перегонит".

Теперь ясно что там происходит? Происходит удерживание белка. Почему? а) Вы уменьшили кол-во соли в элюенте, б) методику писал баран. То есть не настоящий баран, а метафизический. Если бы этот баран прочитал хотя бы мануал по колонке www.chem.agilent.com/cag/prod/ca/gf250-884972-001.pdf
то понял бы, что работать надо на чистом буфере, желательно еще до 40С подняв температуру. Вы видите в мануале где-нибудь упоминание изопропанола? Нет! Раствор 30% изопропанола в воде указано как средство регенерации колонки при прокачке в обратном направлении - и все.

Что же делать? Ответ дан в известной рекламе - ПРОСТО ДОБАВЬ ВОДЫ. Необходимо снизить долю изопропанола в буфере, или вообще его по возможности убрать.
optima
Пользователь
Ранг: 288


24.11.2011 // 19:18:51     
Спасибо! огромное!!! Завтра все попробую.
Изопропанол взялся из фармакопеи.(((
Исходно было 3% (объемных).

  Ответов в этой теме: 33
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты