Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

определение фосфомицина HPLC >>>

  Ответов в этой теме: 31
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: определение фосфомицина HPLC
podlodka
Пользователь
Ранг: 32

06.04.2005 // 16:02:57     
Редактировано 2 раз(а)

Добрый день!
Есть проблема по определению фосфомицина в культуральной жидкости методом HPLC. Есть методика на NH2 колонке в водном элюэнте с KH2PO4, изократика. Детектор рефрактометрический. Но нас не устраивает что в реальных образцах на пик фосфомицина попадают еще какие-то вещества из к.ж. и чувствительность рефрактометра не достаточна. Мы имеем возможность провести анализ на MS-детекторе, но наличие фосфатов там не допускается.
Капиллярный электрофорез работает отлично и с задачей справляется, но заказчик требует HPLC.

Посоветуйте, чем можно заменить KH2PO4 или какие-нибудь другие условия разделения. Имеем возможность работать на Жидкостном хроматографе Alliance с УФ и Масс-селективным детекторами.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


06.04.2005 // 17:01:00     
Какую концентрацию дигидрофосфата и какой рН используете? Какая скорость подачи элюента, есть ли в нем хоть сколько-нибудь органического растворителя? Какой масс-спектрометрический детектор, какой(ие) источник(и) атмосферной ионизации?
podlodka
Пользователь
Ранг: 32


06.04.2005 // 17:25:54     
Редактировано 1 раз(а)


Islander пишет:
Какую концентрацию дигидрофосфата и какой рН используете? Какая скорость подачи элюента, есть ли в нем хоть сколько-нибудь органического растворителя? Какой масс-спектрометрический детектор, какой(ие) источник(и) атмосферной ионизации?
Колонка - NH2 150 Х 2,3 мм
Система - 10.89 г/л KH2PO4 в воде
Скорость потока – 0.2 мл/мин. Насос «Waters 501»
Объем вкалываемой пробы – 1 -10 мкл.
Детектор фирмы «Waters» Differenteal Refractometr R-401

Quattro Micro двойной квадруполь (MS-MS)
масс-спектрометр с двойным квадруполем, предназначенный для работы с источником ионизации при атмосферном давлении (API - Atmospheric Pressure Ionisation ) в составе системы LC-MS

Islander
VIP Member
Ранг: 1065


06.04.2005 // 18:22:31     
Задача не из простых, поскольку ионо-обменная хроматография требует большой ионной силы (у Вас аж 80мМ соли), что плохо совместимо с ионизацией. Опять же, кислый буфер мало подходит для отрицательной ионизации, а положительных ионов из фосфомицина не получить никак. Из положительных моментов можно отметить, что концентрации фосфомицина у Вас, судя по всему, высокие, а Z-spray технически позволяет работать с относительно концентрированными буферами. Так что, если хотите попробовать МС-детектор, вам следует подобрать такой буфер из формата аммония и муравьиной кислоты, чтобы найти компромисс между временем выхода с колонки и чувствительностью детектора. Чем меньше соли и кислоты, тем лучше отклик, но тем больше удерживание. Ионизация - отрицательная ESI.
Другой подход - предварительная очистка проб ТФЭ для существующей методики с рефрактометром. Рекомендую патроны с обращенкой, пробу сильно подкислять. Не исключено, что потребуется и для МС детектора - примеси из Вашего "супа" могут давить ионизацию.
КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


06.04.2005 // 18:32:49     

Да, МС тут проблематично применять. А любые игры с системой могут боком выйти, да и не просто это.

Неужели Ваше вещество совсем не поглощает УФ? Тем более, что его весьма много... Какая у него формула? Не проще ли будет (при хорошей воде и числой соли) поставить 200 нм в крайнем случае?
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


06.04.2005 // 18:43:56     

КонстантинС пишет:
Неужели Ваше вещество совсем не поглощает УФ? Тем более, что его весьма много... Какая у него формула? Не проще ли будет (при хорошей воде и числой соли) поставить 200 нм в крайнем случае?
(2R-cis)-(3-methyloxiranyl)phosphonic acid. Не поглощает. А при 200-х примеси из "супа" так полезут, мало не покажется... Так что если нет ELSD, лучше МS. При высоких концентрациях должно получиться.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
CCS Services CCS Services
Партнер фирмы Varian Analytical Instruments в России, поставляет и обеспечивает полный цикл поддержки аналитического оборудования фирмы. Поставка комплексных решений для лабораторий элементного анализа на базе Атомно-абсорбционных спектрометров (либо ИСП) и систем микроволновой пробоподготовки. Эксклюзивный партнер ведущего европейского производителя систем микроволновой химии - Milestone.
podlodka
Пользователь
Ранг: 32


07.04.2005 // 11:04:35     
Редактировано 2 раз(а)

Спасибо за советы! Попробуем воплотить в жизнь.
Фосфомицин действительно в УФ не поглощает. На форезе мы используем обратное детектирование в буфере с 3,4-дигидроксибензойной кислотой.
КЖ прежварительно пропускаем через ультрафильтрационный катридж. Патроны с обращенкой (Oasis HLB 1cc) в принципе есть в наличии, но условия надо подбирать.
Мы тут уже месяц бьемся над проблемой определения гентамицина в плазме крови. Кучу патронов перевели, но попадая на патрон гентамицин там и остается. Чем только мы его снять не пытались, все бесполезно. Пробовали белки просто осадить (без патрона) ТХУ, солями, органикой... Получаем прозрачный раствор, добавляем в него чистый гентамицин - он бесследно исчезает. В стандарте все отлично - есть. Может что посоветуете?
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


07.04.2005 // 14:13:59     
С фосфомицином может получиться обратное, он может вообще не сесть на картридж, уж больно полярен. Но для него есть другой вариант очистки, муторный, но верный. Это двух-трехкратное соосаждение с фосфатом кальция. Если нужно, могу привести методику поподробнее. Кстати, Вы ведь получаете его в Вашем "супе" из пропилфосфоновой кислоты? Делятся ли исходное вещество и продукт реакции в условиях хроматографии? Далее, насколько я понимаю, в продуктах реакции может также присутствовать малое количество транс-изомера - делятся ли эти изомеры? С изомерами шутки плохи, даже МС-детектор не спасет. Насчет гентамицина посмотрю, когда доберусь до работы.
podlodka
Пользователь
Ранг: 32


07.04.2005 // 14:42:43     
Редактировано 2 раз(а)


Islander пишет:
С фосфомицином может получиться обратное, он может вообще не сесть на картридж, уж больно полярен. Но для него есть другой вариант очистки, муторный, но верный. Это двух-трехкратное соосаждение с фосфатом кальция. Если нужно, могу привести методику поподробнее. Кстати, Вы ведь получаете его в Вашем "супе" из пропилфосфоновой кислоты? Делятся ли исходное вещество и продукт реакции в условиях хроматографии? Далее, насколько я понимаю, в продуктах реакции может также присутствовать малое количество транс-изомера - делятся ли эти изомеры? С изомерами шутки плохи, даже МС-детектор не спасет. Насчет гентамицина посмотрю, когда доберусь до работы.
Если не сложно, то методику поподробнее очень хотелось бы :о)
Мы получаем фосфомицин биосинтезом микроорганизмов, пропилфосфоновой кислоты у нас нет, как продукт распада присутствует в КЖ 1,2 диоксипропанфосфоновая кислота. К сожалению стандарта у меня нет и определить ее время выхода я не могу. Но на капиллярном электрофорезе я наблюдаю помимо фосфомицина еще один широкий пик, вероятно несколько неразделенных веществ, идущих почти вплотную к фосфомицину.
С изомерами у меня пока проблем не возникало,т.к у нас синтезируется только 1,2 цис L изомер.
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


07.04.2005 // 16:02:22     

podlodka пишет:
Мы получаем фосфомицин биосинтезом микроорганизмов, пропилфосфоновой кислоты у нас нет.
Виноват, имел в виду цис-пропенилфосфоновую:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=1368198
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=10049860
примесь транс-продукта никак исключить нельзя.
КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


07.04.2005 // 16:08:16     
Ну, тогда да... Чистить, наверное, надо пробовать. На анионообменнике.

  Ответов в этой теме: 31
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты