| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Подбор УФ прозрачного буфера для методики ВЭЖХ >>>
|
 |
| Автор | Тема: Подбор УФ прозрачного буфера для методики ВЭЖХ |
|
Nitrogen Пользователь Ранг: 11 |
 14.01.2022 // 16:24:49
Доброго времени суток! Есть ситуация: имеем вещество, каликсарен , содержащий 8 отстатков фосфорной кислоты в "короне" и 4 фенильных кольца в чаше. Выделяю его из плазмы крови животных: осаждение белка ТХУ ->твердофазный патрон С18 -> ВЭЖХ на колонке Zorbax CN. Предварительно методика отработана на чистом веществе и его смесях с плазмой крови. Пик каликсарена сходит на начале градиента 0.1М цитрата натрия + цитрата с рН 6.0. Но есть проблема каликсарен поглощает на 210 (за счет фосфорной кислоты, которая в процессе метаболизма или распада отщепляется) и 280 нм (за счет фенильной чаши), цитрат - тоже на 210 , и слабо - на 280 нм. В итоге вышло так что цитрат фонит и мешает выставить нулевую точку - плазму без каликсарена (да закола животным препарата). Взял другой, чистый цитрат, прописал спектр поглощения - слабое поглощение на 280 имеется. Встал вопрос о замене буфера на аналогичный по ионной силе, но УФ прозрачный. Фосфаты и карбонаты использовать производитель колонки не рекомендует. Сульфат натрия посмотрел - тоже поглощает, и сильнее цитрата. Хлориды - выше 0.2М нельзя из-за коррозии поршней на ВЭЖХ Agilent1100, несмотря на то что есть омывающее устройство (10% изопропанол). Вообще, не хочу связываться с хлоридами - случай коррозии был у знакомых. Посоветуйте пожалуйста другой УФ прозрачный вариант буфера. Буду благодарен за помощь и обсуждение. P.S.: метанол + С18 показали себя хорошо в твердофазных патронах, но у меня нет много метанола для работы на полноценной колонке. В этаноле данный каликсарен плохо расстворим. В ацетонитриле он не смывается с колонки - снять его можно только играя ионной силой, поэтому гидрофобные элюенты для этих целей тоже не подойдут. |
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|
vmu Пользователь Ранг: 1394 |
14.01.2022 // 19:15:59
Непонятно про "нулевую точку". На 280 нм с цитратом проблем быть не должно. Что такое ваше "слабое поглощение" цитрата на 280 нм? Грязный цитрат у вас? Приготовьте образец плазмы с добавкой определяемого вещества в концентрации, соответствующей минимуму, который вы хотите определять, и прогоните анализ. Если нормальный пик каликсарена увидите (отношение сигнал/шум не менее 10), то с чувствительностью все в порядке и проблемы нет. Фосфорная кислота и фосфаты не поглощают на 210 нм. Бензольные кольца поглощают и на 280 нм, и на 210 нм сами по себе, без фосфатных групп. Если на 280 нм чутья не хватает, тогда есть смысл подумать про 210 нм, другую ПФ и т.п. Сигнал от целевого вещества будет выше на 210 нм, но селективность методики пострадает (если за счет ВЭЖХ-разделения достаточная селективность не обеспечивается). Шум на 210 нм при прочих равных тоже будет выше, но с нормальной ПФ, не поглощающей на 210 нм, отношение сигнал/шум (а это то, что вас и интересует) должно быть выше. Далее, не путайте pH и ионную силу. Для pH нужен буферный раствор. Для ионной силы - формально любая соль. Сульфат и хлорид не дают никакого буферного эффекта (анионы сильных кислот), но могут использоваться для корректировки ионной силы. Хотя у вас не ионообменная хроматография, поэтому вопрос ионной силы отходит на второй план. Сульфат и хлорид не поглощают значимо на 210 нм. Хлорид ничем не грозит поршням (они из искусственного сапфира), но в некоторой степени грозит стальным капиллярам, но не настолько критично. Главное, не оставляйте систему без потока под солевыми растворами (хоть с хлоридом, хоть с иными солями) без потока ПФ. Фосфат при pH 6 не должен быстро убить вашу колонку. Для создания нужного pH можно много чего использовать, например что-то типа MES: https://en.wikipedia.org/wiki/MES_(buffer) Про проблемы с ацетонитрилом непонятно. Если растворяется в АЦН, если с метанолом на C18 нормально, то с АЦН на C18 тоже должно получаться. Если экономите растворители, берите колонку диаметром поменьше (не 4.6 или 4.0 мм, а 3.0 или 2.1 мм, например). |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 1 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
