Гибридизационный анализ ДНК

Тезисы VII конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2004" »
Устные доклады » Секция 5. Анализ биологических, медицинских и фармацевтических объектов » ...

Гибридизационный анализ ДНК

Зарытова В.Ф.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Академии Наук, Новосибирск. zarytovaniboch.nsc.ru

Метод гибридизационного анализа ДНК обеспечил настоящую революцию в медицинской диагностике онкологических, наследственных и др. заболеваний, в основе которых лежит изменение структуры ДНК. Этот метод состоит из нескольких стадий. Главные из них:

    1.иммобилизация олигонуклеотидов на твердые поверхности,
    2.гибридизация иммобилизованного олигонуклеотида и исследуемой ДНК,
    3.выявление гибридизационного комплекса, образованного иммобилизованным олигонуклеотидом
       и исследуемой ДНК

Мы предложили и разработали новый подход к гибридизационному анализу фрагментов нуклеиновых кислот, позволяющий дискриминировать нормальные ДНК от ДНК, содержащих однонуклеотидные замены. Стратегией предложенного метода является лигирование с помощью Т4 ДНК лигазы кооперативного тандема трех коротких олигонуклеотидов, комплементарных нормальной или мутированной ДНК, с учетом того, что короткие олигонуклеотиды более чувствительны к однонуклеоти- дным мутациям. Показано, что наличие любого однонуклеотидного несоответствия в сайте связывания короткого олигонуклеотида с ДНК, полностью блокирует лигирование тандема и, тем самым, обеспечивает надежную детекцию точечных мутаций в структуре ДНК.

Новизной данного подхода является использование тандема трех коротких олигонуклеотидов, вместо двух протяженных, используемых в литературе. Преимуществом нашей технологии является достижение большей чувствительности при дискриминации нативной и мутированной ДНК, а также возможность использования доступного и недорогого оборудования для считывания полученной информации.

Мы продемонстрировали преимущества нашего метода созданием и использованием различных тест систем для анализа и генотипирования вируса гепатита С, для выявления форм HIV-1, устойчивых к лекарствам, для выявления точечных мутаций R408W в PAN гене человека, который ответственен за фенилкетонурию, для выявления SNP в Tat локусе Y хромосомы человека.