Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Экстракция и очистка фитогормонов для гх-мс >>>

  Ответов в этой теме: 12
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Экстракция и очистка фитогормонов для гх-мс
LVD
Пользователь
Ранг: 219

18.09.2008 // 11:44:25     
Помогите, пожалуйста, разобраться с пробоподготовкой фитогормонов из растительной матрицы к ГХ-МС.
Из навески образца 5 г гомогенизированного в жидком азоте проводим экстракцию в течение часа (регулярно помешивая) (целевые соединения - абсцизовая кислота и индол-3-уксусная кислота, ИУК) 80% охлажденным до 4 град метанолом. В экстракты добавлен антиоксидант (ДТК и ЭДТА).
Раствор центрифугируем (1200 g) 10 мин при 4 град и осадок экстрагируем повторно. Супернатанты объединяем и экстрагируем пигменты и липидные компоненты хлороформом и гексаном последовательно . Раствор выпариваем при 35-45 град до водного остатка и доводим pH до 3 фосфатным буфером.
Фитогормоны экстрагируем диэтиловым эфиром (или этилацетатом) трижды и обезвоживаем эфирную фракцию Na2SO4 . Эфир выпариваем при 35 град, перерастворяем осадок в 200 мл метанола и либо проводим ТСХ очистку (система хлороформ-этилацетат-уксусная кислота 100:100:1). RF-0,5-0,9. Силикагель смываем этилацетатом, упариваем до 500 мкл и силилируем при 90 град 30 мин. В другом варианте перед дериватизацией очищаем в патронах ТФЭ. Патроны ДИАПАК С16, объем 2 мл. Сорбент выбрали согласно литературе. Стандарты искомых кислот через патрон пропускали. При хроматографировании почти всегда получали приличные пики. Однако были пара случаев, когда стандарт исчезал в патроне.Буфер на этапе подготовки патрона - 6 мл 0,1 М KH2PO4(pH 2.7). Ожидаемые концентрации от 10 нг до 1 мкг на мл.
Результат безрадостный - от 1-2 проб слабый сигнал, от 50 - никакой. На самом деле мы перепробовали много вариантов экстракции и очистки, все не опишешь, но без особого успеха. Образцами служили как свежие листья яблони, так и хранившиеся в кельвинаторе при минус 69 град.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Farma
Пользователь
Ранг: 382


18.09.2008 // 16:30:21     

LVD пишет:
Помогите, пожалуйста, разобраться с пробоподготовкой фитогормонов из растительной матрицы к ГХ-МС.
Из навески образца 5 г гомогенизированного в жидком азоте проводим экстракцию в течение часа (регулярно помешивая) (целевые соединения - абсцизовая кислота и индол-3-уксусная кислота, ИУК) 80% охлажденным до 4 град метанолом. В экстракты добавлен антиоксидант (ДТК и ЭДТА).
Раствор центрифугируем (1200 g) 10 мин при 4 град и осадок экстрагируем повторно. Супернатанты объединяем и экстрагируем пигменты и липидные компоненты хлороформом и гексаном последовательно . Раствор выпариваем при 35-45 град до водного остатка и доводим pH до 3 фосфатным буфером.
Фитогормоны экстрагируем диэтиловым эфиром (или этилацетатом) трижды и обезвоживаем эфирную фракцию Na2SO4 . Эфир выпариваем при 35 град, перерастворяем осадок в 200 мл метанола и либо проводим ТСХ очистку (система хлороформ-этилацетат-уксусная кислота 100:100:1). RF-0,5-0,9. Силикагель смываем этилацетатом, упариваем до 500 мкл и силилируем при 90 град 30 мин. В другом варианте перед дериватизацией очищаем в патронах ТФЭ. Патроны ДИАПАК С16, объем 2 мл. Сорбент выбрали согласно литературе. Стандарты искомых кислот через патрон пропускали. При хроматографировании почти всегда получали приличные пики. Однако были пара случаев, когда стандарт исчезал в патроне.Буфер на этапе подготовки патрона - 6 мл 0,1 М KH2PO4(pH 2.7). Ожидаемые концентрации от 10 нг до 1 мкг на мл.
Результат безрадостный - от 1-2 проб слабый сигнал, от 50 - никакой. На самом деле мы перепробовали много вариантов экстракции и очистки, все не опишешь, но без особого успеха. Образцами служили как свежие листья яблони, так и хранившиеся в кельвинаторе при минус 69 град.


Из Вашего весьма подробного текста следует, что Вы наносите фитогормоны на С16 патрон из этилацетата

Считайте, что на основную Вашу ошибку я уже указал. Почитайте теорию ТФЭ или сходите на курсы по ТФЭ.
LVD
Пользователь
Ранг: 219


19.09.2008 // 4:45:17     
Все же текст получился недостаточно подробный. Не наносим мы фитогормоны на С16 патрон из этилацетата, но из 0,1 М K2PO4.
Может еще какие-то ошибки просматриваются?
Курсов по ТФЭ у нас в дальних краях нет. Делаем по
по лит. данным, напр. Liu, S. and Tillberg, E. Physiol.Plants, 57:441-447 (1987), Gaskin, P., MacMillan, Methodoly..."(1992), Birkemeyer, et all, Max-Plank-Institute (J. of Chromatography, 2003, ) и т.д., в том числе и по прописям на сайтах фирм-производителей.
Я понимаю, что методика наша производит впечатление весьма эклектичной, но она такая и есть. Это результат того, что мы пробовали так и эдак, что-то переносили из других методик, но стабильного хорошего результата, увы, не получили.
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


19.09.2008 // 5:18:19     
С учетом того, что оба целевых вещества весьма полярны и к тому же слабые кислоты, лучше использрвать ТФЭ не на обращенке (С16), а на смешанном анионо-обменном сорбенте, типа Oasis MAX (Waters). При этом у Вас появится больше возможностей для промывки. Но и на обращенку из кислой среды (р-р муравьиной кислоты) они тоже должны сесть.
А пытаться кислоты посадить на обращенку из щелочного раствора (0.1 M K2HPO4) - это, простите, из области фантастики.
www.ueb.cas.cz/cz/LABBAL07/2DHPLC%20publ%20article.pdf
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18291140
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18656661
LVD
Пользователь
Ранг: 219


19.09.2008 // 5:40:06     
Огромное Вам спасибо за совет и информацию, будем пробовать.
Всяческих успехов.
LVD
Пользователь
Ранг: 219


19.09.2008 // 5:46:40     
Да, и еще мы не из щелочной среды пропускали образец через патрон, мы после экстракции доводили pH буфера до 2,7 фосфорной кислотой.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
ANCHEM.RU ANCHEM.RU
Интернет-портал химиков-аналитиков ANCHEM.RU – это профессиональный интернет-ресурс, объединяющий людей и организаций, работающих в области химического анализа, сертификации и метрологии.
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


19.09.2008 // 10:03:01     
Редактировано 2 раз(а)

to LVD:
Возникли некоторые мысли, может будут полезны:
1. Деструкция молекул.
2. «…80% охлажденным до 4 град метанолом» - А другие 20% об. - вода? На мой взгляд здесь можно попробовать метанол-этилацетат (что-то вроде 65:35 v/v% - здесь можно «поиграть»).
3. «Супернатанты объединяем и экстрагируем пигменты и липидные компоненты хлороформом и гексаном последовательно» - Хлороформ здесь, на мой взгляд, надо убрать.
4. Насчет ТФЭ – (Islander +) хотел добавить, что подготавливаете патрон (сорбент С16) для ТФЭ для этого случая неправильно и «промывочный элюент» выбран неадекватно, Вы писали: «Условия ТФЭ - кондиционирование метанолом, затем буфером (pH 2,7) после образца промывали метанол:вода 1:4 …» - Сделайте так: берете патрон с сорбентом, промывка метанолом 3-5 г.о.п.(геом.объем патрона,точнее объем занимаемый сорбентом), затем не менее 3 г.о.п. дист. воды, затем 4-5 г.о.п. «буфера» (или другого раствора, в котором будут растворены Ваши сорбаты, рекомендую или ионную силу «буфера» уменьшить до 0.05М или возьмите водный раствор органической кислоты, той же муравьиной, в этом случае дист. водой промывать не надо), затем – через патрон; в стадии промывки можно взять ту же смесь, только рН<рКа (ваших сорбатов), т.е. МеОН: X %v. HCOOHaq. 10-25:90-75 v./v.%, варианты «промывочных» смесей – дело фантазии и от чего хотите избавиться (Вам должно быть виднее) и главное не элюировать целевые сорбаты .
4. Может быть опрометчивый вопрос: Вы имитацию пробы делали или пробы с добавками? Просто таким образом, достаточно легко выявить «фатальные» этапы.

С уважением, Алексей.

З.Ы.: Если работаете с патронами "БХМ ст" - "Диапак" - у них есть руководство по ТФЭ на их сайте. Если есть потребность и желание, напишите на utriv{coбaчkа}mail.ru - когда будет время, скину некоторые материалы по ТФЭ.
LVD
Пользователь
Ранг: 219


19.09.2008 // 10:35:58     
Большое спасибо, Алексей!
Есть и потребность и желание. Будем Вам писать с Вашего разрешения.
biometrology
Пользователь
Ранг: 25


19.09.2008 // 11:41:19     
Коллега!Если не хотите больше мучаться с подобными пассажами
- переходите на подход,который мною апробирован многократно,описан широко в литературе,как "ВСЕ В ОДНОМ ".
Суть состоит в том,что последняя операция по дериватизации и является единственной и достаточной.Вам необходимо только 1.хорошо измельчить продукт 2.Проводить дериватизацию в присутствии сорастворителя,хорошо растворяющего продукт реакции.Я обычно это делаю в присутствии пиридина - ускоряет реакцию силилирования и одновременно участвует в экстракции.
Все это проводится на мг-овых количествах вещества в 2 мл пузырьках для автосамплера (Например - фирмы Агилент).После проведения реакции -экстракции достаточно бывает просто осторожно перенести чистую часть пробы в другой пузырек.Следует заметить,что расчет проводится с учетом общего объема растворителя - который взят в реакцию.Возможен вариант - проводите реакцию,и только затем добавляете корастворитель,например толуол сушеный над сульфатом натрия.

Удачи Александр
Farma
Пользователь
Ранг: 382


19.09.2008 // 18:11:55     

LVD пишет:
Все же текст получился недостаточно подробный. Не наносим мы фитогормоны на С16 патрон из этилацетата, но из 0,1 М K2PO4.
Может еще какие-то ошибки просматриваются?
Курсов по ТФЭ у нас в дальних краях нет. Делаем по
по лит. данным, напр. Liu, S. and Tillberg, E. Physiol.Plants, 57:441-447 (1987), Gaskin, P., MacMillan, Methodoly..."(1992), Birkemeyer, et all, Max-Plank-Institute (J. of Chromatography, 2003, ) и т.д., в том числе и по прописям на сайтах фирм-производителей.
Я понимаю, что методика наша производит впечатление весьма эклектичной, но она такая и есть. Это результат того, что мы пробовали так и эдак, что-то переносили из других методик, но стабильного хорошего результата, увы, не получили.


К сожалению, не могу писать подробно, так как сижу на чемоданах (в командировку улетаю), могу только предложить попробовать перейти на С18 или полистирольные патроны. Удерживание полярных соединений на них будет лучше, а стабильность полимера в кислых условиях по-любому выше. Это первое. Во-вторых я бы отработал версию уважаемого virtu (о деградации Вашего вещества ещё до ТФЭ) и попробовал бы сделать опыт со стандартным веществом (если таковое имеется). Прогоните раствор стандарта через все стадии пробоподготовки и посмотрите выход.
LVD
Пользователь
Ранг: 219


22.09.2008 // 5:54:44     

biometrology пишет:
Коллега!Если не хотите больше мучаться с подобными пассажами
- переходите на подход,который мною апробирован многократно,описан широко в литературе,как "ВСЕ В ОДНОМ ".
Суть состоит в том,что последняя операция по дериватизации и является единственной и достаточной.Вам необходимо только 1.хорошо измельчить продукт 2.Проводить дериватизацию в присутствии сорастворителя,хорошо растворяющего продукт реакции.Я обычно это делаю в присутствии пиридина - ускоряет реакцию силилирования и одновременно участвует в экстракции.
Все это проводится на мг-овых количествах вещества в 2 мл пузырьках для автосамплера (Например - фирмы Агилент).После проведения реакции -экстракции достаточно бывает просто осторожно перенести чистую часть пробы в другой пузырек.Следует заметить,что расчет проводится с учетом общего объема растворителя - который взят в реакцию.Возможен вариант - проводите реакцию,и только затем добавляете корастворитель,например толуол сушеный над сульфатом натрия.

Удачи Александр

Спасибо за очень интересную информацию, попробуем. Опасаемся только, что в реакционную часть перейдет все, кроме липидов, поскольку целевые компоненты водорастворимые, то полезут и сахара и пигменты

  Ответов в этой теме: 12
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты