Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

проблемы с дериватизацией катехоламинов >>>

  Ответов в этой теме: 21
  Страница: 1 2 3
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: проблемы с дериватизацией катехоламинов
Марианна
Пользователь
Ранг: 21

01.07.2008 // 14:09:44     
Здравствуйте. Определяем катехоламины на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором. Воспользовались статьей Yoshitake et all. Они проводят дериватизацию серотонина, норадреналина и дофамина бензиламином в CAPS-буфере (pH 10) в присутствии гескацианоферрата калия. Мы в точности вопроизвели все условия указанные в статье, но результата не получили. Похоже, что не идет реакция. Возможно, необходимы какие-то особые условия (не указанные в статье). Будем благодарны за совет.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Dezh
Пользователь
Ранг: 157


01.07.2008 // 14:13:04     
А поподробнее можно по реакции, как серотонин, например, модифицируется бензиламином - очень интересно!
LVK
Пользователь
Ранг: 37


01.07.2008 // 15:58:54     

Марианна пишет:
Здравствуйте. Определяем катехоламины на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором. Воспользовались статьей Yoshitake et all. Они проводят дериватизацию серотонина, норадреналина и дофамина бензиламином в CAPS-буфере (pH 10) в присутствии гескацианоферрата калия. Мы в точности вопроизвели все условия указанные в статье, но результата не получили. Похоже, что не идет реакция. Возможно, необходимы какие-то особые условия (не указанные в статье). Будем благодарны за совет.
Открываем клуб жертв Yoshitake Реакция-то идёт (у нас дериватизация двойная, по другой их статье, но серотонин с одним бензиламином пробовали). Но чувствительность - по крайней мере с нашим детектором, Agilent G1321A - на 2 порядка ниже, чем у них изображено на графиках.
Dezh
Пользователь
Ранг: 157


01.07.2008 // 16:11:59     
И все-таки интересно... Формулу конъюгата можете привести?
Марианна
Пользователь
Ранг: 21


01.07.2008 // 21:36:47     
Как приятно встретить товарищей по несчастью. Вступить в клуб жертв мы, конечно, согласны.Но хотелось бы еще получить какие-нибудь результаты. Мы сначала также проводили двухшаговую реакцию катехоламинов с бензиламином и дифенилэтилендиамином. После того, как реакция не пошла, провели дериватизацию серотонина, норадреналина, ГИУ и допамина только бензиламином - результат не отличался от предыдущего. Вроде делаем все, как описано в статье - и ничего не видим. А как у вас растворялась CAPS и дифенилэтилендиамин? Последний мы вообще не смогли растворить в 0,1 М HCl, как они предлагают. Детектор у нас - Shimadzu. RF-10Axl.
LVK
Пользователь
Ранг: 37


01.07.2008 // 22:59:06     
Редактировано 1 раз(а)


Dezh пишет:
И все-таки интересно... Формулу конъюгата можете привести?
5-гидроксииндолы + бензиламин: 2-фенил-4,5-пирролобензоксазолы
(4 кольца - 2 от индола, одно от бензиламина и одно замкнувшееся из боковых заместителей ОН- и СH2NH2)
сорри за терминологию, я не химик

pdf могу выслать со схемой реакции, напишите e-mail
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
«МС-АНАЛИТИКА», ЗАО «МС-АНАЛИТИКА», ЗАО
Авторизованный дистрибьютор масс-спектрометрического и хроматографического оборудования Thermo Fisher Scientific
LVK
Пользователь
Ранг: 37


01.07.2008 // 23:31:05     

Марианна пишет:
Как приятно встретить товарищей по несчастью. Вступить в клуб жертв мы, конечно, согласны.Но хотелось бы еще получить какие-нибудь результаты. Мы сначала также проводили двухшаговую реакцию катехоламинов с бензиламином и дифенилэтилендиамином. После того, как реакция не пошла, провели дериватизацию серотонина, норадреналина, ГИУ и допамина только бензиламином - результат не отличался от предыдущего. Вроде делаем все, как описано в статье - и ничего не видим. А как у вас растворялась CAPS и дифенилэтилендиамин? Последний мы вообще не смогли растворить в 0,1 М HCl, как они предлагают. Детектор у нас - Shimadzu. RF-10Axl.

Если брать такие концентрации стандартов, как у Youshitake, так и мы ничего не видим. Возьмите 10 мкМ серотонина и 100 нМ норадреналина или адреналина (рабочие растворы), далее по прописи 20 мкл раб. р-ра + 20 мкл реактива с бензиламином + 20 мкл реактива с DPE, 50 град С 20 минут в Гноме, 20 мкл смеси вколоть - всё прекрасно поделится, с высокими узкими пиками.
Но у нас-то это порядка 100 пикомолей серотонина и 1 пикомоля NA или Адр на вкол, а у них по 50 фемтомолей этих же стандартов видны как на ладони.

CAPS нормально растворяется, DPE в 0,1 N HCl лучше всего погонять через узкий наконечник против света (вортекс его почему-то не берет). А в чем же вы его тогда растворяете - в метаноле?
Dezh
Пользователь
Ранг: 157


02.07.2008 // 9:10:58     

LVK пишет:

Dezh пишет:
И все-таки интересно... Формулу конъюгата можете привести?

pdf могу выслать со схемой реакции, напишите e-mail


Сбросьте dezh(c-а)analytech.ru
Марианна
Пользователь
Ранг: 21


02.07.2008 // 14:01:52     

Если брать такие концентрации стандартов, как у Youshitake, так и мы ничего не видим. Возьмите 10 мкМ серотонина и 100 нМ норадреналина или адреналина (рабочие растворы), далее по прописи 20 мкл раб. р-ра + 20 мкл реактива с бензиламином + 20 мкл реактива с DPE, 50 град С 20 минут в Гноме, 20 мкл смеси вколоть - всё прекрасно поделится, с высокими узкими пиками.
Но у нас-то это порядка 100 пикомолей серотонина и 1 пикомоля NA или Адр на вкол, а у них по 50 фемтомолей этих же стандартов видны как на ладони.

CAPS нормально растворяется, DPE в 0,1 N HCl лучше всего погонять через узкий наконечник против света (вортекс его почему-то не берет). А в чем же вы его тогда растворяете - в метаноле?


После того, как у нас возникли проблемы с растворением DPE, мы пока дериватизируем только бензиламином. Но даже увеличив концентрацию рабочих растворов до указанных вами, не увидели на хроматограмме ничего, кроме двух эндогенных пиков. Внутренний диаметр колонки (в статье) 1,5 мм, а у нас 4,6 мм. Насколько это может влиять?
Растворение CAPS в метаноле начинается только после подогрева и подщелачивания NaOH до pH 10,0. Поясните по поводу DPE - что значит "погонять против света".
А, если не секрет, в чем вы определяете катехоламины? Мы пытаемся определить катехоламины в диализате мозга.
LVK
Пользователь
Ранг: 37


02.07.2008 // 22:33:35     

Марианна пишет:

После того, как у нас возникли проблемы с растворением DPE, мы пока дериватизируем только бензиламином. Но даже увеличив концентрацию рабочих растворов до указанных вами, не увидели на хроматограмме ничего, кроме двух эндогенных пиков. Внутренний диаметр колонки (в статье) 1,5 мм, а у нас 4,6 мм. Насколько это может влиять?
Растворение CAPS в метаноле начинается только после подогрева и подщелачивания NaOH до pH 10,0. Поясните по поводу DPE - что значит "погонять против света".
А, если не секрет, в чем вы определяете катехоламины? Мы пытаемся определить катехоламины в диализате мозга.

Не секрет, в плазме крови людей. В диализате мозга концентрации биогенных аминов, по-моему, еще ниже, чем в плазме. Но я пока говорю исключительно о стандартах - сколько видим мы и сколько Yoshitake.

"Погонять против света" - это значит, что я даже в очках не вижу нерастворившихся кристалликов DPE, пока не помещу за эппендорфом яркую лампу. Может, другие и так увидели бы. Берете сэмплер на 200 мкл и тщательно пипетируете, пока не перестанут взлетать мелкие кристаллики, они почти прозрачные. Эппендорфы у нас тонкие, видно почти как через стекло.

С CAPS вообще не пойму, какая у вас проблема. CAPS buffer pH 10,0 - это и означает, что нужно смешать CAPS с NaOH в таком соотношении, чтобы рН был 10,0. Потом уже добавляется всё остальное - бензиламин, феррицианид и метанол. Я не грею, всё и так растворяется.

Колонка у нас сейчас 2 мм, раньше была 4,5 (тоже всё видели).
Dezh
Пользователь
Ранг: 157


03.07.2008 // 9:39:51     
Посмотрел статью. Представляется, что механизм данного процесса связан с окислением органики гексацианоферратом и образованием промежуточных активных форм как субстрата (окси-индольного фрагмента), так, в принципе и аминов (ВА и DPE). Гексацианоферрат является довольно сильным окислителем, особенно при высоких рН и темп-ре.
Таким образом, можно, на мой взгляд, проверить одну вещь. В дериватизирующий раствор добавлять окислитель непосредственно перед дериватизацией. Также убедится, что гексацианоферрат у вас свежий.
Чувствительность всегда можно поднять за счет пробоподготовки (типа ТФЭ).
Если не поможет - вообще можно попробовать по аминогруппе замещать флуоресцеином и смотреть такие производные.

  Ответов в этой теме: 21
  Страница: 1 2 3
  «« назад || далее »»

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты