Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Подбор УФ прозрачного буфера для методики ВЭЖХ >>>

  Ответов в этой теме: 1

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Подбор УФ прозрачного буфера для методики ВЭЖХ
Nitrogen
Пользователь
Ранг: 11

14.01.2022 // 16:24:49     
Доброго времени суток!

Есть ситуация: имеем вещество, каликсарен , содержащий 8 отстатков фосфорной кислоты в "короне" и 4 фенильных кольца в чаше.
Выделяю его из плазмы крови животных: осаждение белка ТХУ ->твердофазный патрон С18 -> ВЭЖХ на колонке Zorbax CN.
Предварительно методика отработана на чистом веществе и его смесях с плазмой крови.

Пик каликсарена сходит на начале градиента 0.1М цитрата натрия + цитрата с рН 6.0. Но есть проблема каликсарен поглощает на 210 (за счет фосфорной кислоты, которая в процессе метаболизма или распада отщепляется) и 280 нм (за счет фенильной чаши), цитрат - тоже на 210 , и слабо - на 280 нм. В итоге вышло так что цитрат фонит и мешает выставить нулевую точку - плазму без каликсарена (да закола животным препарата).

Взял другой, чистый цитрат, прописал спектр поглощения - слабое поглощение на 280 имеется.
Встал вопрос о замене буфера на аналогичный по ионной силе, но УФ прозрачный.

Фосфаты и карбонаты использовать производитель колонки не рекомендует.
Сульфат натрия посмотрел - тоже поглощает, и сильнее цитрата.
Хлориды - выше 0.2М нельзя из-за коррозии поршней на ВЭЖХ Agilent1100, несмотря на то что есть омывающее устройство (10% изопропанол). Вообще, не хочу связываться с хлоридами - случай коррозии был у знакомых.

Посоветуйте пожалуйста другой УФ прозрачный вариант буфера. Буду благодарен за помощь и обсуждение.

P.S.: метанол + С18 показали себя хорошо в твердофазных патронах, но у меня нет много метанола для работы на полноценной колонке. В этаноле данный каликсарен плохо расстворим. В ацетонитриле он не смывается с колонки - снять его можно только играя ионной силой, поэтому гидрофобные элюенты для этих целей тоже не подойдут.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
vmu
Пользователь
Ранг: 1291


14.01.2022 // 19:15:59     
Непонятно про "нулевую точку". На 280 нм с цитратом проблем быть не должно. Что такое ваше "слабое поглощение" цитрата на 280 нм? Грязный цитрат у вас? Приготовьте образец плазмы с добавкой определяемого вещества в концентрации, соответствующей минимуму, который вы хотите определять, и прогоните анализ. Если нормальный пик каликсарена увидите (отношение сигнал/шум не менее 10), то с чувствительностью все в порядке и проблемы нет. Фосфорная кислота и фосфаты не поглощают на 210 нм. Бензольные кольца поглощают и на 280 нм, и на 210 нм сами по себе, без фосфатных групп.

Если на 280 нм чутья не хватает, тогда есть смысл подумать про 210 нм, другую ПФ и т.п. Сигнал от целевого вещества будет выше на 210 нм, но селективность методики пострадает (если за счет ВЭЖХ-разделения достаточная селективность не обеспечивается). Шум на 210 нм при прочих равных тоже будет выше, но с нормальной ПФ, не поглощающей на 210 нм, отношение сигнал/шум (а это то, что вас и интересует) должно быть выше.

Далее, не путайте pH и ионную силу. Для pH нужен буферный раствор. Для ионной силы - формально любая соль. Сульфат и хлорид не дают никакого буферного эффекта (анионы сильных кислот), но могут использоваться для корректировки ионной силы. Хотя у вас не ионообменная хроматография, поэтому вопрос ионной силы отходит на второй план.

Сульфат и хлорид не поглощают значимо на 210 нм. Хлорид ничем не грозит поршням (они из искусственного сапфира), но в некоторой степени грозит стальным капиллярам, но не настолько критично. Главное, не оставляйте систему без потока под солевыми растворами (хоть с хлоридом, хоть с иными солями) без потока ПФ. Фосфат при pH 6 не должен быстро убить вашу колонку.

Для создания нужного pH можно много чего использовать, например что-то типа MES:
https://en.wikipedia.org/wiki/MES_(buffer)

Про проблемы с ацетонитрилом непонятно. Если растворяется в АЦН, если с метанолом на C18 нормально, то с АЦН на C18 тоже должно получаться. Если экономите растворители, берите колонку диаметром поменьше (не 4.6 или 4.0 мм, а 3.0 или 2.1 мм, например).

  Ответов в этой теме: 1

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты