| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Изменение полярности ПФ в ВЭЖХ >>>
|
 |
| Автор | Тема: Изменение полярности ПФ в ВЭЖХ | |||||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
 31.07.2015 // 20:48:51
Редактировано 2 раз(а) Добрый вечер, глубокоуважаемые коллеги! Имею вопрос сугубо практического толка: с помощью ВЭЖХ (Zorbax, C-18, 150x4.6 mm, 5 mkm, 100A) используя в качестве ПФ ацетонитрил:ацетон 1:1 (об/об), 1 мл/мин, декторы рефрактометрический и ДАД (регистрация хроматограммы на 205 нм) делю sn-1.2-диацил-3-ацетил-глицерины (АцДАГ). В целом наблюдаю около 8 главных пиков, что даже коррелирует с позиционно-видовым составом, вычисленным по ЖК-составу продуктов их неполного липазного гидролиза. Сам метод взял из одной из статей, но там делили во-первых, ТАГ (а они менее полярны, по сравнению с АцДАГ), а во-вторых, на анлогичной колонке, но длиной 250 мм, а потому первые молекулярные вид ТАГ элюировались где-то через 3-4 минуты после "пика" от ввода пробы. В моём же случае, первые фракции выходят практически без удерживания. В какую сторону следует изменять соотношение ацетон:ацетонитрил, чтобы увеличить время удерживания? Стоит ли уменьшить поток ПФ? В ВЭЖХ я совсем новичок (2 месяц пошёл эксплуатации), так что прошу совета опытных и мудрых старейшин, в надежде сэкономить время, элюенты и ресурс дейтериевой лампы  У Садека сказано, что на С18 элюирующая сила ацетона 8,8, а ацетонитрила -- 3,1. Чтобы уменьшить элюирующую силу, я должен уменьшить долю ацетона? Правильно? И второй вопрос: можно ли на С18 добиться того, чтобы ТАГ не делились по молекулярным видам, а выходили единственным пиком, от отделялись при этом, скажем, от метиловых эфиров ЖК и от свободных ЖК, диацилглицеринов? Какими растворителями для этой задачи лучше пользоваться? Или такое разделение лучше доверить колонке типа SIL? Заранее благодарю за советы! |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
horizon Пользователь Ранг: 46 |
31.07.2015 // 22:21:36
Здравствуйте! Во-первых, как связаны ацетон и 205 нм? Во-вторых, нужно уменьшать полярность элюента. Я бы попробовал этанол или ТГФ. |
|||||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
31.07.2015 // 22:47:50
Редактировано 1 раз(а) Учитывая, что DAD при запуске анализа обнуляется, то все работает нормально -- нулевая линия стабильна... хроматограмма вполне нормальная получается (на рефрактометре гораздо печальнее, но с ним я ещё не разбирался). То, что с ацетоном в УФ работать невозможно, я знаю и сам не раз видел это, но если элюирование изократическое и других ПФ в системе нет, то все нормально с нулевой
|
|||||
|
vmu Пользователь Ранг: 1234 |
31.07.2015 // 23:15:29
Редактировано 1 раз(а) Да, чтобы снизить элюирующую способность ацетонитрил-ацетонового элюента на неполярном сорбенте (ОДС) нужно уменьшить долю ацетона (т.е. увеличить полярность элюента). Ацетон в ПФ и ДАД на 205 нм есть плохо, т.к. ацетон хорошо поглощает при такой длине волны. Чувствительность будет низкой (детектор формально обнуляет уровень фона в начале хроматограммы, но не уменьшает амплитуду шумов, которая тем больше, чем больше фоновое поглощение излучения). Если хотите использовать ДАД, нужно использовать другие растворители вместо ацетона (изопропанол, метил-трет-бутиловый эфир и т.п.) или водно-органический элюент. Посмотрите еще лит-ру. Вот пара первых попавшихся ссылок для затравки: Скорость потока ПФ нормальная для данных условий. Учтите, что для улучшения разделения вам нужно не просто увеличить времена удерживания компонентов, а их факторы удерживания (k'), которые зависят от состава ПФ, но не от скорости. |
|||||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
01.08.2015 // 0:28:02
Уп-с..я даже таблицу неправильно читал )) но мыслил в целом в нужном направлении Спасибо А что по поводу второго вопроса можете подсказать? Работать с С18 или проще это решить с помощью SIL? |
|||||
|
vmu Пользователь Ранг: 1234 |
01.08.2015 // 16:44:52
Редактировано 1 раз(а) Зачем добиваться, чтобы ТАГ выходили одним пиком? Пусть себе делятся и выходят группой пиков, если они отделяются и от других компонентов и это будет не в ущерб другим параметрам анализа (продолжительности и т.п.). Сам я такой задачей не занимался. Из общих соображений, отделяться ТАГ от ДАГ, от МЭ соответствующих ЖК и от самих ЖК должны без особых проблем что в случае ОФ ВЭЖХ (silica-C18), что в случае НФ ВЭЖХ (silica): по гидрофобности/полярности группы этих веществ заметно отличаются. ОФ ВЭЖХ в целом менее "капризный" вариант ВЭЖХ. С другой стороны, для таких гидрофобных веществ, растворимых в неполярных органических растворителях, с ходу я посоветовал бы НФ ВЭЖХ. Короче, поищите еще готовые решения в лит-ре. |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
01.08.2015 // 19:28:02
ТАГ одним пиком, как и другие ацилсодержащие липиды типа ДАГ, МАГ etc нужны для того, чтобы во-первых по калибровочной кривой оценить содержание ТАГ, а во вторых, с помощью коллектора фракций собрать их все для определения их ЖК-состава. На С-18 ТАГи делятся на т.н. критические пары-тройки, состоящие из близких по хроматографическим параметрам молекулярных видов, которые практически невозможно разделить, а так же на отдельные молекулярные виды типа триолеина, трилинолеина и т.д., конечно, можно собрать все фракции ТАГ, объединить, но что-то подсказывает, что когда фракция собирается в 1 виалу, а не в 9-15, её состав впоследствии будет более точно определён. И потом, времена удерживания ТАГ занимают минут 15 и нет гарантии, что вместе с ними не будут элюироваться другие липиды. В общем, нужно чтобы один класс липидов давал 1 пик для построения т.н. липидных профилей исследуюемых объектов. |
|||||
|
vmu Пользователь Ранг: 1234 |
01.08.2015 // 20:48:49
Редактировано 1 раз(а) А чувствительность детектора к различным ТАГ идентична? Вряд ли. В этом случае количественный анализ по пику неразделенных ТАГ будет правильным, только если соотношение различных ТАГ во всех анализируемых образцах и в калибровочных образцах будет одинаковым, чего, конечно же, нет. Чем больше различия в чувствительности, тем больше погрешность суммарного содержания (с таким же успехом можно использовать и сумму площадей пиков разделенных ТАГ). У вас вообще есть стандарты отдельных ТАГ? Как вы потом определяете ЖК состав ТАГ в собранной фракции? При наличии стандартов и хорошем разделении уже времена удерживания пиков будут давать информацию о структуре ТАГ (не 100% надежно, но все же; вы же хотите сознательно снизить селективность методики и говорите, что в смешанной фракции потом точнее определите ЖК состав). При элюировании ТАГ одним пиком у вас еще меньше гарантий, что с ними не будут элюироваться какие-то мешающие компоненты. |
|||||
|
vmu Пользователь Ранг: 1234 |
01.08.2015 // 21:32:27
Если все же нужно выделить ТАГи в виде одной более-менее узкой фракции, то делается градиентное элюирование. Относительно слабым элюентом (или плавным градиентом) вымываете из колонки МАГи и ДАГи, а затем круто увеличиваете элюирующую силу и вымываете ТАГи (возможно, с примесью каких-то ДАГов, близких по гидрофобности к каким-то ТАГам). |
|||||
|
КонстантинС VIP Member Ранг: 2306 |
21.08.2015 // 1:40:39
205 нм и ацетон - это полная ерунда. предъявите хроматограммы |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 9 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
