Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Изменение полярности ПФ в ВЭЖХ >>>

  Ответов в этой теме: 9

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Изменение полярности ПФ в ВЭЖХ
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1282

31.07.2015 // 20:48:51     
Редактировано 2 раз(а)

Добрый вечер, глубокоуважаемые коллеги!
Имею вопрос сугубо практического толка:
с помощью ВЭЖХ (Zorbax, C-18, 150x4.6 mm, 5 mkm, 100A) используя в качестве ПФ ацетонитрил:ацетон 1:1 (об/об), 1 мл/мин, декторы рефрактометрический и ДАД (регистрация хроматограммы на 205 нм) делю sn-1.2-диацил-3-ацетил-глицерины (АцДАГ). В целом наблюдаю около 8 главных пиков, что даже коррелирует с позиционно-видовым составом, вычисленным по ЖК-составу продуктов их неполного липазного гидролиза.
Сам метод взял из одной из статей, но там делили во-первых, ТАГ (а они менее полярны, по сравнению с АцДАГ), а во-вторых, на анлогичной колонке, но длиной 250 мм, а потому первые молекулярные вид ТАГ элюировались где-то через 3-4 минуты после "пика" от ввода пробы.
В моём же случае, первые фракции выходят практически без удерживания.
В какую сторону следует изменять соотношение ацетон:ацетонитрил, чтобы увеличить время удерживания? Стоит ли уменьшить поток ПФ?
В ВЭЖХ я совсем новичок (2 месяц пошёл эксплуатации), так что прошу совета опытных и мудрых старейшин, в надежде сэкономить время, элюенты и ресурс дейтериевой лампы
У Садека сказано, что на С18 элюирующая сила ацетона 8,8, а ацетонитрила -- 3,1. Чтобы уменьшить элюирующую силу, я должен уменьшить долю ацетона? Правильно?
И второй вопрос: можно ли на С18 добиться того, чтобы ТАГ не делились по молекулярным видам, а выходили единственным пиком, от отделялись при этом, скажем, от метиловых эфиров ЖК и от свободных ЖК, диацилглицеринов? Какими растворителями для этой задачи лучше пользоваться? Или такое разделение лучше доверить колонке типа SIL?

Заранее благодарю за советы!
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
horizon
Пользователь
Ранг: 46


31.07.2015 // 22:21:36     
Здравствуйте! Во-первых, как связаны ацетон и 205 нм? Во-вторых, нужно уменьшать полярность элюента. Я бы попробовал этанол или ТГФ.
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1282


31.07.2015 // 22:47:50     
Редактировано 1 раз(а)


horizon пишет:
Здравствуйте! Во-первых, как связаны ацетон и 205 нм? Во-вторых, нужно уменьшать полярность элюента. Я бы попробовал этанол или ТГФ.
Учитывая, что DAD при запуске анализа обнуляется, то все работает нормально -- нулевая линия стабильна... хроматограмма вполне нормальная получается (на рефрактометре гораздо печальнее, но с ним я ещё не разбирался).
То, что с ацетоном в УФ работать невозможно, я знаю и сам не раз видел это, но если элюирование изократическое и других ПФ в системе нет, то все нормально с нулевой
vmu
Пользователь
Ранг: 742


31.07.2015 // 23:15:29     
Редактировано 1 раз(а)

Да, чтобы снизить элюирующую способность ацетонитрил-ацетонового элюента на неполярном сорбенте (ОДС) нужно уменьшить долю ацетона (т.е. увеличить полярность элюента).
Ацетон в ПФ и ДАД на 205 нм есть плохо, т.к. ацетон хорошо поглощает при такой длине волны. Чувствительность будет низкой (детектор формально обнуляет уровень фона в начале хроматограммы, но не уменьшает амплитуду шумов, которая тем больше, чем больше фоновое поглощение излучения). Если хотите использовать ДАД, нужно использовать другие растворители вместо ацетона (изопропанол, метил-трет-бутиловый эфир и т.п.) или водно-органический элюент. Посмотрите еще лит-ру. Вот пара первых попавшихся ссылок для затравки:

www.crawfordscientific.com/downloads/Application-Notes/RRHD/High-Resolution_Analysis_of_Intact_Triglycerides_using_the_Agilent_1290_Infinity_and_ZORBAX_Eclipse_Plus_SB_C18.pdf

www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-5674EN.pdf

Скорость потока ПФ нормальная для данных условий. Учтите, что для улучшения разделения вам нужно не просто увеличить времена удерживания компонентов, а их факторы удерживания (k'), которые зависят от состава ПФ, но не от скорости.
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1282


01.08.2015 // 0:28:02     

vmu пишет:
Да, чтобы снизить элюирующую способность ацетонитрил-ацетонового элюента на неполярном сорбенте (ОДС) нужно уменьшить долю ацетона (т.е. увеличить полярность элюента).


Уп-с..я даже таблицу неправильно читал )) но мыслил в целом в нужном направлении Спасибо
А что по поводу второго вопроса можете подсказать? Работать с С18 или проще это решить с помощью SIL?
vmu
Пользователь
Ранг: 742


01.08.2015 // 16:44:52     
Редактировано 1 раз(а)

Зачем добиваться, чтобы ТАГ выходили одним пиком? Пусть себе делятся и выходят группой пиков, если они отделяются и от других компонентов и это будет не в ущерб другим параметрам анализа (продолжительности и т.п.). Сам я такой задачей не занимался. Из общих соображений, отделяться ТАГ от ДАГ, от МЭ соответствующих ЖК и от самих ЖК должны без особых проблем что в случае ОФ ВЭЖХ (silica-C18), что в случае НФ ВЭЖХ (silica): по гидрофобности/полярности группы этих веществ заметно отличаются. ОФ ВЭЖХ в целом менее "капризный" вариант ВЭЖХ. С другой стороны, для таких гидрофобных веществ, растворимых в неполярных органических растворителях, с ходу я посоветовал бы НФ ВЭЖХ. Короче, поищите еще готовые решения в лит-ре.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Экоаналитика, Эколого-аналитическая ассоциация Экоаналитика, Эколого-аналитическая ассоциация
Ассоциация является независимой творческой организацией, объединяющей на добровольной основе более 40 организаций России из различных областей науки, её практических приложений и системы образования. Ассоциация располагает собственной научной и производственной базой. Производит более 100 наименований стандартных образцов и аттестованных растворов.
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1282


01.08.2015 // 19:28:02     

vmu пишет:
Зачем добиваться, чтобы ТАГ выходили одним пиком?

ТАГ одним пиком, как и другие ацилсодержащие липиды типа ДАГ, МАГ etc нужны для того, чтобы во-первых по калибровочной кривой оценить содержание ТАГ, а во вторых, с помощью коллектора фракций собрать их все для определения их ЖК-состава. На С-18 ТАГи делятся на т.н. критические пары-тройки, состоящие из близких по хроматографическим параметрам молекулярных видов, которые практически невозможно разделить, а так же на отдельные молекулярные виды типа триолеина, трилинолеина и т.д., конечно, можно собрать все фракции ТАГ, объединить, но что-то подсказывает, что когда фракция собирается в 1 виалу, а не в 9-15, её состав впоследствии будет более точно определён. И потом, времена удерживания ТАГ занимают минут 15 и нет гарантии, что вместе с ними не будут элюироваться другие липиды. В общем, нужно чтобы один класс липидов давал 1 пик для построения т.н. липидных профилей исследуюемых объектов.
vmu
Пользователь
Ранг: 742


01.08.2015 // 20:48:49     
Редактировано 1 раз(а)

А чувствительность детектора к различным ТАГ идентична? Вряд ли. В этом случае количественный анализ по пику неразделенных ТАГ будет правильным, только если соотношение различных ТАГ во всех анализируемых образцах и в калибровочных образцах будет одинаковым, чего, конечно же, нет. Чем больше различия в чувствительности, тем больше погрешность суммарного содержания (с таким же успехом можно использовать и сумму площадей пиков разделенных ТАГ). У вас вообще есть стандарты отдельных ТАГ? Как вы потом определяете ЖК состав ТАГ в собранной фракции? При наличии стандартов и хорошем разделении уже времена удерживания пиков будут давать информацию о структуре ТАГ (не 100% надежно, но все же; вы же хотите сознательно снизить селективность методики и говорите, что в смешанной фракции потом точнее определите ЖК состав). При элюировании ТАГ одним пиком у вас еще меньше гарантий, что с ними не будут элюироваться какие-то мешающие компоненты.
vmu
Пользователь
Ранг: 742


01.08.2015 // 21:32:27     
Если все же нужно выделить ТАГи в виде одной более-менее узкой фракции, то делается градиентное элюирование. Относительно слабым элюентом (или плавным градиентом) вымываете из колонки МАГи и ДАГи, а затем круто увеличиваете элюирующую силу и вымываете ТАГи (возможно, с примесью каких-то ДАГов, близких по гидрофобности к каким-то ТАГам).
КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


21.08.2015 // 1:40:39     
205 нм и ацетон - это полная ерунда. предъявите хроматограммы

  Ответов в этой теме: 9

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты