Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Гель-проникающая хроматография >>>

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Гель-проникающая хроматография
vas20
Пользователь
Ранг: 26

20.11.2013 // 0:19:58     
Редактировано 1 раз(а)

Добрый вечер! Пожалуйста, дайте совет, кто занимался эксклюзионной хроматографией.
Нам поставлена задача разделить белки. Мы собираемся использовать метод гельпроникающей ( эксклюзионной) хроматографии. У нас есть сорбент сефадекс 20. Мы собираемся сделать колонку и попробовать разделить белки этим методом...
Есть ли у кого-нибудь методичка, как постадийно сделать это.
У нас возникло несколько вопросов:
1) нужен ли стандарт
2) в одном из источников написано:
Жидкость, вытекающую из колонки и содержащую разделенные белки, собирают в отдельные пробирки. Содержание белка там определяют с помощью специфических реакций или измеряя поглощение ультрафиолета
Как ориентироваться, что фракция закончилась?

Можно ли реализовать метод гель-хроматографии используя ВЭЖХ-УФ? Нужна ли покупать специальную колонку с сефадекс 20 или можно обойтись самодельной?
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Insatiable
Пользователь
Ранг: 1


20.11.2013 // 12:44:23     
Редактировано 1 раз(а)

Добрый! Методичка на что?? Как собирать колонку или разделение белков эксклюзионной хроматографией ? Вообще наверное корректней говорить мануал если на прибор/колонку или НД, если на процесс. Вообще что Вам нужно сделать как я понимаю. Берете препаративную колонку, заполняете ее сорбентом, например сефарозой и вместе с подвижной фазой загоняете вашу смесь из белков. Далее первыми выйдут белки с большей молекулярной массой и т.д. Концентрацию, которых при необходимости можете определить спец. методами, например Лоури, Бредфорда..
1) Нужен ли стандарт ? Тут хотелось бы узнать цель вашей работы/задачи просто разделить смесь? Разделить и выделить какой то определенный белок? Получить с определенной мол. массой ? Всегда есть варианты(стандарты белка, стандарты с определенными молекулярными массами).
2) Когда начинать/заканчивать отбирать фракции вы будете судить по хроматограмме (и исходя из ваших задач). В любом случае после окончания хроматограммы отбирать уже нечего, кроме ПФ.
Реализовать можно. Можно обойтись самодельной колонкой, только вопрос в объемах/количествах пробы, нужно учитывать емкость колонки.
Garry
VIP Member
Ранг: 1076


20.11.2013 // 15:17:06     

vas20 пишет:
Добрый вечер! Пожалуйста, дайте совет, кто занимался эксклюзионной хроматографией.
Нам поставлена задача разделить белки. Мы собираемся использовать метод гельпроникающей ( эксклюзионной) хроматографии. У нас есть сорбент сефадекс 20. Мы собираемся сделать колонку и попробовать разделить белки этим методом...
Есть ли у кого-нибудь методичка, как постадийно сделать это.
У нас возникло несколько вопросов:
1) нужен ли стандарт
2) в одном из источников написано:
Жидкость, вытекающую из колонки и содержащую разделенные белки, собирают в отдельные пробирки. Содержание белка там определяют с помощью специфических реакций или измеряя поглощение ультрафиолета
Как ориентироваться, что фракция закончилась?

Можно ли реализовать метод гель-хроматографии используя ВЭЖХ-УФ? Нужна ли покупать специальную колонку с сефадекс 20 или можно обойтись самодельной?


Девени, Гергей "Аминокислоты, пептиды, белки". В этой книженции найдете много интересного. На Сефадексе 20, Вы можете разделить только низкомолекулярные белки (см. интернет или литературу). Этот Сефадекс в основном используют для обессоливания высокомолекулярных белков.
Стандарты масс естественно нужны. Обычно их заказывают у Sigma. Там специальные наборы с голубым декстраном для определения Vо. Для работы нужна колонка с Сефадексом G75 или подходящего для Ваших масс, перистальтический насос, УФ детектор и коллектор фракций для сбора элюата.Можно, конечно обойтись и без детектора, но тогда возникает "гемморой" с определением наличия белка в каждой пробирке, следующей за Vо-объемом. Если белки разделены хорошо, то кривая выхода фракции будет выглядеть Гауссианой, то бишь хроматографическим пиком, начало этого пика - начало выхода фракции, а конец-естественно - конец выхода фракции. Вижу чтоВаши познания не глубоки,.... поэтому, как говорят наши киты-учите матчасть.... А вот за деталями, добро пожаловать...на форум.
vas20
Пользователь
Ранг: 26


20.11.2013 // 22:44:22     
Спасибо за советы. Я много времени занимался газовой хроматографией, на ВЭЖХ определял только бензапирен.

С гель-хроматографией столкнулся впервые. Как я понял она отличается только по механизму разделения, присутствует только ситовой эффект, никаких адсорбционных и абсорбционных взаимодействий между сорбентом и подвижной фазой ( элюент+аналит) не происходит.

Значит надо просто поставить колонку с "гелевой фазой" и в качестве детектора использовать УФ или рефрактометр и работать также как и с обычной ВЭЖХ в обращенном фазовом варианте.
1) подобрать элюент
2) приготовить и откалиброваться стандартным раствором ,
3) вколоть раствор белка и получить хроматограмму
4) провести количественный анализ
Волгин
VIP Member
Ранг: 1312


21.11.2013 // 0:21:04     
Редактировано 2 раз(а)


vas20 пишет:
... присутствует только ситовой эффект, никаких адсорбционных и абсорбционных взаимодействий между сорбентом и подвижной фазой ( элюент+аналит) не происходит... Значит надо..
Очень хотелось бы, чтобы это было так! К сожалению в очень большом количестве случаев избежать адсорбции и/или ионных взаимодействий не удается или удается с большим трудом. Иначе зачем до нынешнего времени приходится работать на сефадексах, сефарозах и т.п., очень капризных с точки зрения современной хроматографии. "Значит надо" очень тщательно подбирать сорбент. Но и это не всё. Белки обладают на наше несчастье еще и третичной структурой, что влияет на их размеры по разному в разных условиях. Поэтому калибровка по веществам иной природы годится только в денатурирующих условиях, и то не всегда. А калибровка по другим белкам (я в данном случае пишу о калибровке по молекулярным массам, дай бог, чтобы она Вам не понадобилась) также не очень подходит, так как каждый белок ведет себя при данных условиях по своему. И это еще не все! Принято считать, что эксклюзионная хроматография разделяет полностью вещества (белки) различающиеся по массе в лучшем случае в 2 раза. Отсюда возможность ошибки при количественном определении...
Впрочем я этим видом хроматографии занимался крайне мало. Если ошибаюсь, "пусть старшие товарищи меня поправят!"
PS Да, и еще была монография Остермана "МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ". В том числе там описывалась и хроматография.
PPS Не знал. Есть еще его же "Хроматография белков и нуклеиновых кислот "
cholesterol
Пользователь
Ранг: 109


21.11.2013 // 23:31:19     
Ионные взаимодействия подавляются при использовании разбавленного солевого раствора (0,05-0,2 М NaCl). Для ослабления гидрофобных взаимодействий в элюент вводят детергенты или добавки органических растворителей. Взаимодействие за счет образования водородных связей подавляются введением мочевины. Все эти эффекты выражены тем сильнее, чем больший внутренний объем занимает сам материал матрицы. Эффекты убывают в ряду G10-G15-G25-G50. Для G75 уже пренебрегают.

Матрицам на основе акриламида в меньшей степени, чем сефадексам свойственна ионная сорбция, но гидрофобную сорбцию они проявляют заметно. Агароза обнаруживает склонность как к гидрофобной сорбции, так и к ионной.

Все, что влияет на молекулярный гидродинамический объем влияет на "размер" молекулы (молекулярная масса, третичная структура, плотность упаковки (денатурированность), гидратированность, способность адсорбировать малые молекулы и т.д.)

При выборе сорбента одной из главной характеристикой является объем пор, т.к. высокая пористость позволяет в большей степени разрешить малые молекулы от больших. Также необходимо смотреть на средний размер частиц, распределение частиц по размерам, средний диаметр пор, распределение пор по размерам, причем чем меньше частицы и более узкое распределение по размерам, тем лучше.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Wiegand International Wiegand International
Компания Wiegand International на протяжении 10 лет осуществляет поставку лабораторного оборудования ведущих немецких производителей для лабораторий косметической, фармацевтической, химической и молочной промышленности. Комплексное оснащение лабораторий любого профиля и любого уровня сложности.
vas20
Пользователь
Ранг: 26


22.11.2013 // 0:45:04     
Редактировано 1 раз(а)

Спасибо за советы, все оказалось гораздо сложней, чем мы думали. Впереди много сюрпризов.
Если кто занимался разделением, не могли бы "ткнуть носом" (дать ссылку) колонки, которую лучше купить и что-нибудь для постадийной работы, как это представлено в книжке в пункте 3.
polly.phys.msu.ru/ru/labs/Blagodatskikh/chromatography.pdf

PS: У нас этим будет заниматься сотрудница и от меня требуется представить и разъяснить как можно больше информации. В современных книжках и пособиях везде одни полимеры www.chem.agilent.com/Library/primers/Public/5990-7196RU.pdf , белки только в классических книжках ссылки которые вы мне давали....
kump
Пользователь
Ранг: 2909


23.11.2013 // 23:28:57     

vas20 пишет:
Спасибо за советы, все оказалось гораздо сложней, чем мы думали. Впереди много сюрпризов.



Давно этим занимался. Лет 20 назад. Дипломная работа. Там, помнится весьма непросто правильно заполнить колонку, равномерно осаждая сефадекс в потоке. Требуется тренировка. Позаботьтесь об консервации колонки, обычно азидом натрия, иначе на ней начнут расти грибы и попрёт всякая дрянь.

Определяли помнится олигопептиды в ферметативных и микробиологических гидролизатах казеина на G-25 элюент 0,85% NaCl
Калибровали V0 голубой декстран 2000000 дальтон. триптофан 204 д. эритромицин 800 д. полимиксин 1400д. детектор 254нм обьём пробы 0,2мл колонка диаметр 10мм длина 250мм
Всё получалось хорошо.
cholesterol
Пользователь
Ранг: 109


24.11.2013 // 16:48:00     

vas20 пишет:
Если кто занимался разделением, не могли бы "ткнуть носом" (дать ссылку) колонки, которую лучше купить и что-нибудь для постадийной работы

Если Вы находитесь в Москве, то на выставке Фармтех 2013 на стенде № B178 будет представитель Tosoh Biosciences (ФизЛабПрибор), я, думаю, он может чего-нибудь и посоветует и подберет.
Волгин
VIP Member
Ранг: 1312


24.11.2013 // 18:14:55     
Я бы не стал так доверять фирмачам. Они зациклены не на задачу, а на то, как бы впендюрить свой продукт. Читайте, слушайте, советуйтесь!
AA_Alex
Пользователь
Ранг: 352


25.11.2013 // 13:23:43     

vas20 пишет:
Добрый вечер! Пожалуйста, дайте совет, кто занимался эксклюзионной хроматографией.
Нам поставлена задача разделить белки. Мы собираемся использовать метод гельпроникающей ( эксклюзионной) хроматографии.
Можно ли реализовать метод гель-хроматографии используя ВЭЖХ-УФ?

Пожалуйста, подробнее про задачу - какие белки, разделить смесь из 2-3 белков с разной мол массой или выделить и очистить белок/белки из гомогената/лизата/КЖ/и т.п.?
Если вы хотите ВЭЖХ, то нужны фирменные колонки (они довольно дорогие), но это только для очень маленьких количеств белка. Даже полупрепаратив в таком варианте - очень дорого. Если делать самим колонки - то нужен просто перистальтический насос и детектор, никаких ВЭЖХ. Короче плясать от задачи, вариантов много. Судя по вопросам опыта работы с белками мало. Посмотрите для начала хотя бы Скоупса Методы очистки белков и Остермана Хроматография белков - несложно скачать в электр виде.

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты