Форумы ANCHEM.RU: препаративная ВЭЖХ белков

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

препаративная ВЭЖХ белков >>>

  Ответов в этой теме: 25
  Страница: 1 2 3
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

epanchintsev
Пользователь
Ранг: 14

07.04.2013 // 10:30:47

>> не приобрести ли маленький насосик специально для введения пробы. Скажем, К120 от Кнауэра, или что-то подобное

- А какие выгоды нам сулит подключение еще одного внешнего насоса?
- Или мне все-таки следует опасаться, что введение пробы напрямую через системный насос может самым неблагоприятным образом скажется на его работоспособности?
- Можно ли будет такую вновь получившуюся систему дополнить ручным трехходовым клапаном (который бы выдерживал давление на 400 бар), чтобы можно было выбирать с какого насоса нам подавать элюент на колонну (системного либо внешнего), или придется без конца перекручивать фитинги на колонне?
- Мне это кажется, или на самом деле, при использовании внешнего насоса сбор данных о разделении будет неполным, скажем, мы не сможем толком (в том числе для последующего анализа) задукоментировать этап нанесения.

>> И вообще, если Вы в Москве, свяжитесь со мной, может подъедете, вместе подумаем над вариантами
Спасибо, но к огромному моему сожалению - пока нет такой возможности - работаю в Томске.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

epanchintsev
Пользователь
Ранг: 14

07.04.2013 // 10:32:47

cholesterol пишет:
Хотел внести свои 5 копеек к ответу Юры Волгина.
1) Если pH исходной смеси 6 и выше имеет смысл помимо добавления ацетонитрила подкислить до pH=4-5.
2) После того как нанесете раствор белка обязательно промойте колонку буфером не содержащим соль, т.к. при элюировании в градиенте от 30 до 80% ацетонитрила высок риск выпадения неорганических солей.

спасибо большое
принимаю к сведению

epanchintsev
Пользователь
Ранг: 14

07.04.2013 // 10:36:00

Редактировано 1 раз(а)

Serga пишет:
Тут все неправильно изначально. Зачем для очистки белка использовать системы ВЭЖХ, если для этого существуют специальные варианты FPLC (та же хроматография гидрофобных взаимодействий)? Приемы работы давно отработаны до мелочей. Агилент, Термофинниганы, Шимадзы и прочий народ на этом не специализируются. (Потому у них моск вскипел ).
Обратитесь в компанию GE Healthcare (бывшая LKB Pharmacia и т.д.),
www.gehealthcare.com/ruru/
в московии есть русский бранч, очень приличные спецы, русскоговорящие сотрудники, они мгновенно подберут всю необходимую аппаратуру и буклеты. Нефиг изобретать велосипед и гонять белки на неприспособленном для этих целей ВЭЖХ.

Спасибо за Ваше мнение

На предварительных этапах очистки, в том числе и c помощью FPLC , будет получена довольно гомогенная фракция белка (скажем более 90% чистоты по SDS-PAGE), далее с помощью RP-HPLC (которая по идее должна должна выдать нам более высокую разрешающую способность) будет стоять задача разделить, скажем так ,«изомеры» белка, имеющие одну и ту же аминокислотную последовательность (или отличающиеся всего на одну АК), но имеющие между собой различие в пространственной укладке, за счет различных комбинаций замыкания дисульфидных связей.

С сорбентами и хроматографами генерала электрика имею десятилетний опыт практической работы, их SOURCE 15 мкм тоже будет апробирован для этих задач.

(( я и с сам не в восторге от упавшей на меня препаративной ВЭЖХ. но поделать ничего не могу

Serga
Пользователь
Ранг: 1806

07.04.2013 // 11:07:50

epanchintsev пишет:
работаю в Томске.

Очень мило. Насколько мне известно, в Томске такое оборудование имеет только ФГУП НПО ВИрион, там и работаете? Но еще интереснее- это что ж за проблема такая возникла, с белком? И почему без ВЭЖХ- никак? Там ведь без спец колонок растеряется вся активность? Или не?

epanchintsev
Пользователь
Ранг: 14

07.04.2013 // 11:21:55

Редактировано 1 раз(а)

Serga пишет:

epanchintsev пишет:
работаю в Томске.
Очень мило. Насколько мне известно, в Томске такое оборудование имеет только ФГУП НПО ВИрион, там и работаете? Но еще интереснее- это что ж за проблема такая возникла, с белком? И почему без ВЭЖХ- никак? Там ведь без спец колонок растеряется вся активность? Или не?

ну не только...
скажем в политехе есть АКТА пайлот и на химфаке ТГУ explorer вроде был
тем не менее, такая проницательность делает Вам честь ))
с Вашего позволения - не стану вдаваться в более тонкие подробности - а то боюсь меня обвинят в разглашении коммерческой тайны и выгонят с завода на улицу

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

ФГУП УНИИМ
Уральский научно-исследовательский институт метрологии. Государственный научный метрологический центр, Головной орган Государственной службы стандартных образцов, Соответствие системе менеджмента качества ИСО/МЭК 17025, ИСО 34)

Волгин
VIP Member
Ранг: 1326

08.04.2013 // 2:56:51

Редактировано 1 раз(а)

epanchintsev пишет:
- А какие выгоды нам сулит подключение еще одного внешнего насоса?
- Или мне все-таки следует опасаться, что введение пробы напрямую через системный насос может самым неблагоприятным образом скажется на его работоспособности?
- Можно ли будет такую вновь получившуюся систему дополнить ручным трехходовым клапаном (который бы выдерживал давление на 400 бар), чтобы можно было выбирать с какого насоса нам подавать элюент на колонну (системного либо внешнего), или придется без конца перекручивать фитинги на колонне?
- Мне это кажется, или на самом деле, при использовании внешнего насоса сбор данных о разделении будет неполным, скажем, мы не сможем толком (в том числе для последующего анализа) задукоментировать этап нанесения.

- Все-таки следует. Загадите насос пробой, потом можете долго отмывать. Впрочем, для Кнауэровского это также справедливо, но его гидравлическая схема существенно проще, внутренний объем меньше, поэтому на очистку уйдет меньше растворителя. В принципе можно и родным насосом подавать образец, поставив на входе трех- (или более) –ходовой кран с подходящей пропускной способностью, но – см.начало абзаца.
- А зачем Вам вообще это усложнение. С этой задачей прекрасно справятся выходные клапана насосов, не давая потоку пойти куда-либо, кроме колонки. Так что перекручивать ничего не придется. Просто тройник между насосами и колонкой.
- А вот на этот вопрос я Вам ответить не смогу, поскольку с управляющей программой не знаком. Единственное, что могу заметить, это то, что у К120 есть управление по RS232 и кроме того контакты Start/Stop. www.knauer.net/fileadmin/user_upload/produkte/files/Dokumente/pumps/knauer/manuals/V7517_m_eg_pu_k-120.pdf Так что все зависит от Вашего желания и умения.

Serga
Пользователь
Ранг: 1806

08.04.2013 // 6:06:25

epanchintsev пишет:
...FPLC , будет получена довольно гомогенная фракция белка (скажем более 90% чистоты по SDS-PAGE), далее с помощью RP-HPLC (которая по идее должна должна выдать нам более высокую разрешающую способность)

Вы пытаетесь совместить несовместимое или достичь какой-то нереальной эффективности, непонятно зачем. Когда твердят о препаративной ВЭЖХ- о какой эффективности может идти речь? И ни по какой "идее" более высокую эффективность вы не полУчите от ВЭЖХ. Пытаясь переключиться с FPLC на ВЭЖХ вы ввергаете компанию в траты, а результат будет, скорее всего, ничтожным. (Если вообще не отрицательным). Все то же самое можно проделать на AKTA Explorer/Purifier. Разделить препаративно белок с различием в 1-2 АК в первичной структуре ВЭЖХ не сумеет лучше, чем FPLC. Какая проблема насоса может стоять при наличии АКТА?

Надо было в первую очередь пробовать Source, а потом уж рассуждать о препаративной ВЭЖХ. Утерянную активность вы лопатой потом будете соскребать с сорбентов, шлангов и стенок колонки для ВЭЖХ?

epanchintsev
Пользователь
Ранг: 14

08.04.2013 // 10:41:34

Редактировано 1 раз(а)

to Волгин

спасибо - все понятно

epanchintsev
Пользователь
Ранг: 14

08.04.2013 // 10:46:36

Редактировано 3 раз(а)

>> И ни по какой "идее" более высокую эффективность вы не полУчите от ВЭЖХ.

Идея очень простая
Чем меньше зернение сорбента – тем лучше разделение при одном методе.
На 90 мкм сорбентах – под что заточены системы промышленной очистки FPLC отт GE (типа АКТА process и др / операционное давление системы и колонн 6 бар, сорбента 2 бара) разделение будет явно хуже, чем на 7-10 мкм зерне препаративных промышленных HPLC систем.

Согласен у GE есть промышленные системы для, так скажем полуHPLC (до 80 бар (на самом деле ориентироваться нужно на 40-60) – под сорбенты 15-30 мкм), но стоят они ну очень недешево (думаю, смело можно расcчитывать на суммы от 30 000 000 рублей). Спрашивается - нафига мне усеченный вариант, когда за те же деньги я могу рассчитывать на нормальную систему 200 – 300 бар.

epanchintsev
Пользователь
Ранг: 14

08.04.2013 // 11:03:22

впрочем, я понял Вашу позицию, что
что FPLC для моих задач подходит гораздо лучше чем ВЭЖХ, а имеющийся у меня в наличие метод очистки - просто никуда не годится.
более того - я полностью ее разделяю.
Теперь, если у Вас есть какие-либо мысли по сабжу - прошу их высказать. если таких мыслей нет - то давайте завершим нашу дискуссию.


Ответов в этой теме: 25 Страница: 1 2 3 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты