Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Изопреноиды и каротеноиды в растворителях >>>

  Ответов в этой теме: 10

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Изопреноиды и каротеноиды в растворителях
mashum
Пользователь
Ранг: 6

17.03.2012 // 22:26:39     
Редактировано 2 раз(а)

Здравствуйте! Я сама физиолог растений, и мне нужно посмотреть активность нескольких вариантов белка in vitro. Белок - фитоен синтетаза, который работает в паре с GGPP-синтетазой, соответственно, мне нужно посмотреть, как эффективно у меня делается фитоен. В реакцию я добавляю оба фермента, плюс 14С-IPP, DMAPP, отбираю аликвоты с интервалом времени, и потом из них изолирую фитоен, который должен включить метку, и его считаю на сцинцилляторе. Вот с экстракцией фитоена у меня и связаны вопросы.

Вот выдержка из иетодика из статьи в журнале:
200 ul Samples were extracted by partitioning twice against 200 and 100 μL of butanol. The combined butanol phases containing geranygeranyl-diphosphate were mixed with 300 μL of a 1 M methanolic MgCl2 solution and partitioned against 300 μL heptane to recover the phytoene that was quantified by liquid scintillation counting.

Т.е. я так поняла, что нужно сначала фракционировать с бутанолом, и в него перейдет GGPP и фитоен. Это я сделала, отделила в результате 300 мкл фракцию бутанола. Зачем потом смешивать с хлоридом магния в метаноле? Я смешала, получила 600 мкл бутанол-метаноловой смеси, в которую добавила (тут, видимо, критическая ошибка?) - гексан, т.к. гептана под рукой не нашлось. Быстрый просмотр в интернете сообщил, что они примерно одно и то же в смысле растворения, поэтому я решила, что сгодится.
Потрясла, открутила, получила странное - 100 мкл нижняя фаза, 800 мкл верхняя фаза. Это что за фазы теперь, и где фитоен?
(Я, конечно, померяла радиоактивность во всех фазах, которые у меня остались, и надеялась определить методом тыка, т.к. пробы из общей реакции я отбирала по временным интервалам, никакой зависимости количества радиоактивности от времени я не нашла, теперь вот разбираюсь, где напортачила).

Спасибо за ответы заранее!
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1257


18.03.2012 // 13:01:59     
Редактировано 3 раз(а)


mashum,
а не могли ли ваши белки коагулировать в спирте и потерять активность + выпасть в осадок (100 мкл нижней фракции при центрифугировании)?
Свободный фитоен вряд ли будет растворим в полярном растворителе типа спирта. Он любит петролейный эфир, н-гексан, гептан А в спирте тоже выпадет в осадок в виде белой блямбы. Пробовали снять надосадочную жидкость, а осадок перерастворить в гексане? Как он себя ведёт в этом случае?
mashum
Пользователь
Ранг: 6


18.03.2012 // 19:19:01     
Редактировано 3 раз(а)


Chamomillablue пишет:

mashum,
а не могли ли ваши белки коагулировать в спирте и потерять активность + выпасть в осадок (100 мкл нижней фракции при центрифугировании)?
Свободный фитоен вряд ли будет растворим в полярном растворителе типа спирта. Он любит петролейный эфир, н-гексан, гептан А в спирте тоже выпадет в осадок в виде белой блямбы. Пробовали снять надосадочную жидкость, а осадок перерастворить в гексане? Как он себя ведёт в этом случае?

да, конечно, могли бы (да и пускай теряют активность, ведь они мне уже не нужны, только фитоен посчитать надо), но никакого осадка при центрифугировании я не видела... может, просто их очень мало? и фитоена, и белков - поэтому фитоен и радиокативный, увидеть его нельзя, но посчитать можно.

Я, честно говоря, запуталась совсем в этой реакции, хотя на вид описание выглядит многообещающе несложным.
Вот полный текст:
15 micrograms of recombinant purified His6-At-PSY and 22 μg of purified His6-GGPS were incubated in 4.5-mL reaction buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.6, 2 mM MnCl2, 1 mM TCEP, 0.08% [v/v] Tween 80, 10 mM MgCl2, and 20% [v/v] glycerol) and phosphatidylcholine liposomes in a final concentration of 62.5 ng μL−1. The reaction was initiated by adding 20 μM dimethylallyl-diphosphate and 20 μM [1-14C] IPP (50 mCi mmol−1), fivefold isotope-diluted with unlabeled IPP prior to use. Incubation took place at 20°C under continuous stirring. At given time intervals, 200-μL aliquots were withdrawn and the reaction stopped by adding EDTA to a final concentration of 40 mM. Samples were extracted by partitioning twice against 200 and 100 μL of butanol. The combined butanol phases containing geranygeranyl-diphosphate were mixed with 300 μL of a 1 M methanolic MgCl2 solution and partitioned against 300 μL heptane to recover the phytoene that was quantified by liquid scintillation counting.

С белками проблемы нет, должны быть активные, предположим, не в них проблема - даже если в них, то разберусь сразу же после того, как разберусь, где искать фитоен

Да, и собственно, можно было бы попробовать на глазок туда-сюда покрутить, повстряхивать с одним-другим, и рано или поздно выяснить все методом научного тыка, но есть одна проблема - 10 uCi 14-С меченого IPP стоят $1000.. так что хотелось бы разобраться теоретически...
Спасибо!
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1257


18.03.2012 // 23:01:01     
Редактировано 1 раз(а)


mashum
, попробуйте в токе аргона или гелия отдуть спирт досуха, а затем гексаном экстрагировать фитоен.
Не уверен, что гексан и метанол не смешиваются и потом расслаиваются... Но фитоен должен быть в гексановой фракции, ибо он неполярен.
Ну или второй вариант: пока поработать без метки, а фитоен детектировать с помощью HPLC-DAD (методик полно) или с помощью TLC.
mashum
Пользователь
Ранг: 6


19.03.2012 // 3:23:07     
Редактировано 4 раз(а)

Отдуть от чего? на какой стадии? Вот что статья мне сообщает:
1. Возьмите 200 мкл водно-липидно-глицерольного раствора, содержащего [14C]-IPP, GGPP, DMAPP, [14-C]-phytoene.
2. Смешайте с бутанолом, сначала с 200 мкл, открутите, отберите бутанол, потом с 100 мкл, открутите, отберите бутанол.

3. Бутанол содержит GGPP (вопрос: а фитоен тоже там? как он там оказался, если он плохо растворим в бутаноле?), вот эти 300 мкл бутанола смешайте с MgCl2 в метаноле.
(зачем смешивать с метанолом и с хлоридом магния?)

3. Смешайте ваши 600 мкл с 300 мкл гептана, открутите. Фитоен будет в нем. (вопрос - как фитоен перейдет в гептан, он же плохо растворяется в бутаноле-метаноле, т.е. он там все-таки был?? второй вопрос - при откручивании получилось нижняя фракция 100 мкл, верхняя 800 мкл, что из них гептан (или гексан) и почему его теперь не 300 мкл?)

вполне возможно что я не так понимаю, что там написано. а может там специально так написано, чтобы никто не смог повторить, если что. поэтому и пытаюсь разобраться, что вообще авторы имели ввиду? это химически вообще возможно? может, они пишут, что с одной фракцией работали, а на самом деле работают с другой?? например, бутанол убирают, а гексан добавляют к тому что осталось? почему сразу гексан или гептан не добавить к реакционной пробе, зачем эта вся свистопляска со спиртами??

HPLC - это долгий разговор, т.к. я им не владею толком, но можно этот вопрос решить, если не удастся разобраться теоретически что должно происходить.
Андрейвладими
Пользователь
Ранг: 136


19.03.2012 // 13:19:01     
Редактировано 1 раз(а)

"200 ul Samples were extracted by partitioning twice against 200 and 100 μL of butanol. The combined butanol phases containing geranygeranyl-diphosphate were mixed with 300 μL of a 1 M methanolic MgCl2 solution and partitioned against 300 μL heptane to recover the phytoene that was quantified by liquid scintillation counting. "
Добрый день. Ваш продукт очень гидрофобен, практически как вазелин. Когда вы добавляете бутанол, вы получаете смесь, где в обоих фазах основные компоненты - вода и бутанол, с каждой экстракцие доля бутанола растёт, но вода все равно остаётся. Phytoene в этих смесях будет растворятся очень - очень плохо. Если его мало, то он спокойно "сядет" на стенки виалки, испачкав её, как суп пачкает жиром тарелку. Всё.
С моей точки зрения экстрагировать надо гептаном или более высококипящими насыщеными углеводородами. Гексан летит слишком хорошо, не так удобно работать. Гептан достаточно доступен. Органический слой будет сверху. Если слои будут плохо делиться, поможет фугование. Если даже оно не поможет, отфильтруйте через целит (не через уголь или другие сорбенты!!!) и промойте целит гептаном, разделиться. Ну и считайте гептановый слой.
P.S. Почему в статье так описан эксперимент, не знаю, но на полный бред в описании экперимента (в органическом синтезе) натыкался не раз, особенно в статьях и патентах за последние десятилентия и у индусов.
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
НИКИ МЛТ, ООО НИКИ МЛТ, ООО
Научно-исследовательский и конструкторский институт медицинской лабораторной техники. Разрабатывает и производит приборы для: санитарного контроля воздуха; экологического контроля воздуха; метеорологического контроля воздуха.
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1257


19.03.2012 // 14:10:24     
Редактировано 1 раз(а)

MgCl, вероятно, добавляют для предотвращения деградации изопреноидов, но не уверен. Может и для чего-то другого (я хоть и физиолог растений, но специализация совсем далёкая).
Отдуть инертным газом спирты я бы попробовал на этапе "добавьте гептан"...
Если вы в МСК, то гептаном могу поделиться
mashum
Пользователь
Ранг: 6


19.03.2012 // 17:22:56     
Редактировано 2 раз(а)

Я вполне допускаю, что все делали по вышеописанной методике только "потому что так тут заведено"
Но тем не менее, последний вопрос. В изначальной реакции все изопреноиды и фитоен находятся в липосомах - мембранных везикулах, которые плавают в водном растворе. Задача - отделить и посчитать фитоен, и не считать меченый isopentyl pyrophosphate. Так вот может эти спирты нужны чтобы отделить IPP? Он растворится в гептане, если сразу гептаном фракционировать?

Chamomillablue,
Спасибо за гептан, но я не в Мск найдем, чего уж, сказали нужен гептан - значит гептан будет
Андрейвладими
Пользователь
Ранг: 136


19.03.2012 // 18:52:42     

mashum пишет:
Я вполне допускаю, что все делали по вышеописанной методике только "потому что так тут заведено"
Но тем не менее, последний вопрос. В изначальной реакции все изопреноиды и фитоен находятся в липосомах - мембранных везикулах, которые плавают в водном растворе. Задача - отделить и посчитать фитоен, и не считать меченый isopentyl pyrophosphate. Так вот может эти спирты нужны чтобы отделить IPP? Он растворится в гептане, если сразу гептаном фракционировать?

Chamomillablue,
Спасибо за гептан, но я не в Мск найдем, чего уж, сказали нужен гептан - значит гептан будет

Добрый вечер.
Это сильно усложняет задачу.
Iisopentyl pyrophosphate в гептан ну никак не пойдёт, а вот продукт его гидролиза, которй идёт и без фермента, соответствующий спирт, (этот спирт как раз и меченый), из воды в гептан уйдёт, пусть и не на 100%. Его Т кипения ~140 С. Соупарить экстракт пару раз с ксилолом, и его останутся ну просто следы, но для меченых соединений это, наверное, не вариант - много вокруг испачкаете. Может быть можно просто упарить насухо, сконденсировав всё, что улетит.

Но, скорее всего, именно из - за наличия метки надо тащить продукт только экстракцией (ну или "твердофазной экстракцией"). В идеале - проконсультироваться с тем, кто спец в раздельной экстракции природных объектов. Я не спец.
Или поискать статью, где бы другими авторами были описаны подобные эксперименты.

С точки зрения простоты и минимального количества операций можно, наверное, сделать так:
1) + MeOH, 200 (???400???) ul
2) центрифугирование и отделение водно - метанольной фазы (Она, наверное, будет над осадком, а может сверху будет плавать нерастворимая плёнка). Повторить промывку водой с метанолом. И пирофосфат и спирт ?изопрениловый? отмоются.
3) фитоен экстрагировать из осадка гептаном на узи - бане, фуговать, гептановый экстракт отделять и считать.
mashum
Пользователь
Ранг: 6


19.03.2012 // 19:56:48     
Редактировано 2 раз(а)

Спасибо!
Потихоньку проясняется.
насчет подобных экспериментов - есть очень старые статьи биохимические, разных видов, но все используют другой подход, сразу кормят фитоен-синтазу GGPP меченым, а нам надо чтобы с двумя белками работало.

Дело в том, что осадка там никакого нет, и пленки тоже не будет - т.к. это все микроколичества и глазом их не видно. На вид - вода-водой, ну разве что фазы иногда можно разглядеть при экстракции.

В общем, попробуем, потрясем-покрутим еще разок.
mashum
Пользователь
Ранг: 6


20.03.2012 // 19:17:18     
Редактировано 1 раз(а)

Внимание, правильный ответ, полученный после пары дней курения учебников, спрашивания химиков вокруг, и практического трясения пробирок в руках
Фитоен, конечно, не любитель бутанола, но тем не менее вместе с GGPP переходит в бутанол, т.к. бутанол менее полярный, чем вода. Фитоен в липосомах, все они вместе дружно переходят в бутанол. Бутанол если насыщенный, то еще лучше - не забирает воду из реации, соответственно меньше шансов подхватить изопреноиды.

С метанолом нужно смешивать, т.к. гексан(гептан) с метанолом не смешивается и фракционируется, хлорид магния там чтобы убрать из раствора в осадок все варианты изопреноидов. Со смесью бутанола-метанола гексан фракционируется не так здорово, как с метанолом вообще, и не фракционируется ни с одним из них пока их не засунуть в лед (этого я не знала). Поэтому у меня такие странные фракции были - реакция была из морозилки, а растворители комнатной температуры, вот и делились как попало.

Фитоен остается более-менее очищенный в верхней фракции гексана.

Все оказалось просто

  Ответов в этой теме: 10

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты