Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Различные отклики при использовании разного ацетонитрила >>>

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Различные отклики при использовании разного ацетонитрила
boberk
Пользователь
Ранг: 105

27.12.2011 // 11:13:18     
Редактировано 8 раз(а)

Добрый день.
Разрешите обратиться за консультацией.
Ситуация следующая: на протяжении 2 лет использовали хроматографический метод для определения концентрации белка. Хроматограмма имела постоянный вид. Подвижные фазы:
A)H2O(pH=2 ТФУ)
B) ACN/H2O=90/10(pH=2 ТФУ)
Градиент
0% - 0мин
100% - 14мин

Однако месяц назад вид хроматограммы существенно изменился (см. Рис). Предположили, что это связано с плохим качеством ACN. Использовали ACN пропущенный через колонку и затем перегнанный. Вид хроматограммы вернулся к прежнему.

Однако главным было то, что и отклик белка на предположительно плохом ацетонитриле увеличился в 5 раз при детекции на 215 нм.

На приведенном рисунке концентрация белка одинакова. Верхняя хроматограмма отвечает регенерированному ацетонитрилу и соответствует стандартному виду на протяжении 2 лет, нижняя-предположительно плохому ацетонитрилу.

Вопрос: С чем может быть связан, по Вашему мнению, этот факт?

Заранее большое спасибо за помощь.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
makcity
Пользователь
Ранг: 2


27.12.2011 // 12:25:10     
А вы какой квалификацией ACN пользуетесь?
Kalambet
Пользователь
Ранг: 484


27.12.2011 // 12:32:18     
Ваш плохой ацетонитрил на самом деле оказался хорошим. На 215нм очень мало света и, соответственно, большая ошибка измерения. Если посмотреть на УФ спектр, то в районе 215 он будет иметь максимум и при более коротких длинах волн скорее всего начнет загибаться вниз (чисто аппаратный эффект, не имеющий отношения к "настоящему" спектру белка), причем положение максимума зависит от количества света, т.е. от оптической чистоты ацетонитрила. Чем чище ацетонитрил, тем ближе к 190 сдвигается максимум. Длину волны детектирования белка следует выбирать так, чтобы замена растворителя не слишком влияла на отклик - т.е. ближе к 220-230 (а то и 280) нм. Поскольку вам все равно перекалибровываться - одновременно с перекалибровкой смените длину волны.
boberk
Пользователь
Ранг: 105


27.12.2011 // 13:17:16     
Спасибо за совет. Действительно, при детектировании на 280 нм различия в площадях не превышают 5%. Однако чем можно объяснить такое различие профилей хроматограмм? Ведь в случае плавного увеличения доли ацетонитрила и подъем должен быть плавным?
boberk
Пользователь
Ранг: 105


27.12.2011 // 13:36:13     

makcity пишет:
А вы какой квалификацией ACN пользуетесь?

Acetonitrile EMPLURA®
virtu
VIP Member
Ранг: 2135


27.12.2011 // 16:33:55     
Редактировано 2 раз(а)

1. Наиболее вероятно, что дело в ТФУК (деградация, испарение и т.д. в пользу этой версии - уменьшение удерживания и "фона"). А в общем, у Вас просто "фон" разный, соотв. и площади пиков тоже.

2. ВЭЖХ условия (градиент, как минимум) нужно оптимизировать. Градиент слишком "кривой", да и в "B" должна быть ТФУК. "Некрасивые же картинки"

3. Рекомендую, если есть возможность, использовать 280нм. В общем, чтобы там ни писали, при ОФ ВЭЖХ с ТФУК, если белок "поглощает" при 260-280нм, то лучше использовать 260-280нм, чем 210-220нм.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
AAC Спектрометр Analytik Jena contrAA® AAC Спектрометр Analytik Jena contrAA®
Атомно-абсорбционные спектрометры высокого разрешения с одним непрерывным источником спектра – ксеноновой лампой – и двойным монохроматором для проведения мультиэлементного анализа без смены ламп.
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
boberk
Пользователь
Ранг: 105


27.12.2011 // 16:45:05     
Большое спасибо. На самом деле, в B тоже есть ТФУ. Ошибся. А какая из этих хроматограмм ближе к истинной по профилю?
virtu
VIP Member
Ранг: 2135


27.12.2011 // 16:48:38     

boberk пишет:
А какая из этих хроматограмм ближе к истинной по профилю?
Это Вы должны сказать
Kalambet
Пользователь
Ранг: 484


28.12.2011 // 8:45:37     
Редактировано 1 раз(а)

Несложно заметить, что профиль с новым ацетонитрилом ближе к линейному росту, чем со старым. Со старым у вас относительно правильный профиль только до уровня около 1500мВ. Дальше идет зашкал детектора и показаниям верить не стоит. У большинства детекторов на выходе 1AU/1V и выше 1.5AU света на детекторе почти нет и он нелинеен.
Если вам хватает чувствительности на 280, пользуйтесь 280 - там у белка локальный максимум и детектирование очень надежное. В короткие длины волн имеет смысл двигаться, если не хватает чувствительности на 280 и нужно ловить следовые количества белка.
Волгин
VIP Member
Ранг: 1326


28.12.2011 // 13:04:25     
Добавлю свои 5 копеек. В ацетонитриле, там где S=251 присутствуют примеси, которые не сразу выходят из колонки, а сначала накапливаются, а затем начинают смываться в процессе градиента. Этим объясняется непрямолинейность кривой. Примесей много и их поглощение сравнимо с поглощением Вашего белка, поэтому пик маленький на их фоне. В случае S=1090 примесей существенно меньше, поэтому и пик выше.
Kalambet
Пользователь
Ранг: 484


28.12.2011 // 20:13:32     

Волгин пишет:
Добавлю свои 5 копеек. В ацетонитриле, там где S=251 присутствуют примеси, которые не сразу выходят из колонки, а сначала накапливаются, а затем начинают смываться в процессе градиента. Этим объясняется непрямолинейность кривой. Примесей много и их поглощение сравнимо с поглощением Вашего белка, поэтому пик маленький на их фоне. В случае S=1090 примесей существенно меньше, поэтому и пик выше.

Юра, на фоне такого зашкала по-моему, никакие примеси увидеть невозможно - только килограмм белка. А нелинейность вполне объясняется зашкалом - чем больше процент ацетонитрила, тем больше поглощение раствора, а выше 1...1.5AU все детекторы с оптическим путем 1см нелинейны. А белок виден на фоне 2500 mV, т.е. 2.5ЕОП! Никакой чувствительности там и в помине быть не может - непонятно, как белок вообще увидели.

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты