Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Выбор колонки для гель-фильтрации >>>

  Ответов в этой теме: 16
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Выбор колонки для гель-фильтрации
Entomo
Пользователь
Ранг: 9

16.09.2011 // 22:13:26     
Уважаемые форумчане,

История такая. Появилась возможность купить колонку для гель-фильтрации. Но с выбором ее самим не определиться.
Работаем, главным образом, с пептидами, причем, чаще всего их молекулярная масса оказывается менее 10 кДа. Можно ли с помощью данного метода разделить такие мелкие молекулы?
Буду благодарен, если посоветуете конкретную колонку, оптимальную для этих целей, с конкретными параметрами и указанием производителя.

Изначально планировали делить пептидные соединения по какому-либо признаку, отличному от степени гидрофобности, как мы это делаем на ВЭЖХ колонке С-18. Решили выбрать в качестве этого признака размер пептида. Оптимален ли вообще выбор гель-фильтрации в этом случае? Может, появились какие-то более чувствительные методы фракционирования по размеру частиц?

Сразу же скажу, что в ряде случаев работаем с неизвестными пептидами, то есть не знаем их свойств, кроме относительной молекулярной массы (определяем ультрафильтрацией) и степени гидрофобности (определяем твердофазной экстракцией). Местонахождение в какой-либо из фракций определяем по реакции на нее клеточной культуры и бактерий в антимикробном тесте.

Если это существенное дополнение, то хроматограф наш - марки "SHIMADZU")

Спасибо.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Farma
Пользователь
Ранг: 382


19.09.2011 // 15:42:59     

Entomo пишет:
Уважаемые форумчане,

История такая. Появилась возможность купить колонку для гель-фильтрации. Но с выбором ее самим не определиться.
Работаем, главным образом, с пептидами, причем, чаще всего их молекулярная масса оказывается менее 10 кДа. Можно ли с помощью данного метода разделить такие мелкие молекулы?
Буду благодарен, если посоветуете конкретную колонку, оптимальную для этих целей, с конкретными параметрами и указанием производителя.

Изначально планировали делить пептидные соединения по какому-либо признаку, отличному от степени гидрофобности, как мы это делаем на ВЭЖХ колонке С-18. Решили выбрать в качестве этого признака размер пептида. Оптимален ли вообще выбор гель-фильтрации в этом случае? Может, появились какие-то более чувствительные методы фракционирования по размеру частиц?

Сразу же скажу, что в ряде случаев работаем с неизвестными пептидами, то есть не знаем их свойств, кроме относительной молекулярной массы (определяем ультрафильтрацией) и степени гидрофобности (определяем твердофазной экстракцией). Местонахождение в какой-либо из фракций определяем по реакции на нее клеточной культуры и бактерий в антимикробном тесте.

Если это существенное дополнение, то хроматограф наш - марки "SHIMADZU")

Спасибо.


ИМХО не нужна Вам гель-фильтрация, а нужна нормальная С18 колонка, возможно широкопористая. Для гельфильтрации значение будет иметь не только размер молекулы, но и разница в размерах отдельных компонентов смеси. Если она несущественная, то намучаетесь. Если не секрет, чем ОФ не устраивает?
Garry
VIP Member
Ранг: 1076


19.09.2011 // 16:09:31     
Либо ионообменная колонка. Можно воспользоваться анионообменником типа АХ. Либо С 18 с ПФ имеющей в составе ТФУ 0,1 %, потому как нормальная гель-фильтрация начинается от 1000 кДа, а такие массы как 10 кДа - нонсенс для ГПХ, равзве что капиллярный
Garry
VIP Member
Ранг: 1076


19.09.2011 // 16:09:58     
Либо ионообменная колонка. Можно воспользоваться анионообменником типа АХ. Либо С 18 с ПФ имеющей в составе ТФУ 0,1 %, потому как нормальная гель-фильтрация начинается от 1000 кДа, а такие массы как 10 кДа - нонсенс для ГПХ, равзве что капиллярный электрофорез.
Entomo
Пользователь
Ранг: 9


19.09.2011 // 18:04:31     

Нет-нет, я ни в коем случае не отрекаюсь от ОФ. Колонка С18 с 0,1% ТФУ - это наш основной помощник в разделении образцов. Ну, та же ионная пара по сути получается, ведь так?

Просто, помимо гидрофобности хочется еще по какому-нибудь признаку поделить. Выбрали размер. Хотелось бы фракции, полученные ОФ ВЭЖХ, прогнать через гельфильтрационную колонку.

По размеру, начиная от 100 кДа? Наверное, Вы путаете гельфильтрацию с гель-проникающей хроматографией (ну, судя по той литературе, которую я успел на выходных проштудировать).
В настоящее время колонки для разделения мелочи есть. В итоге остановились на BioSep SEC-S 2000 фирмы Phenomenex. Не знаю, оправдан ли выбор.. Но подобные аналоги существуют и у других фирм. Еще будет возможность изменить свой выбор, если он не очень удачен.

Так что жду комментариев.

Всем спасибо за советы.

AA_Alex
Пользователь
Ранг: 343


19.09.2011 // 18:31:16     

Entomo пишет:


По размеру, начиная от 100 кДа? Наверное, Вы путаете гельфильтрацию с гель-проникающей хроматографией (ну, судя по той литературе, которую я успел на выходных проштудировать).
В настоящее время колонки для разделения мелочи есть. В итоге остановились на BioSep SEC-S 2000 фирмы Phenomenex. Не знаю, оправдан ли выбор.. Но подобные аналоги существуют и у других фирм. Еще будет возможность изменить свой выбор, если он не очень удачен.

Так что жду комментариев.

Всем спасибо за советы.



Слышал хорошие отзывы о Вотерсовских колонках для ГПХ. У них есть и для "мелких" молекул (100-5КД и 100-10КД):
www.waters.com/waters/nav.htm?locale=ru_RU&cid=513226

Сам на таких не работал. А Вы пептиды, случайно, не из гемолимфы насекомых выделяете (судя по нику Entomo)?

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Низкотемпературный инкубатор UT-5110 Низкотемпературный инкубатор UT-5110
Используются для хранения культур и сыворотки, а также для различных медицинских целей, решения задач в области защиты и охраны окружающей среды и тестирования микроорганизмов. Объем камеры: 150 л. Температурный диапазон: от -10 до +65°С
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
абр
Пользователь
Ранг: 881


19.09.2011 // 19:33:17     

Entomo пишет:
Наверное, Вы путаете гельфильтрацию с гель-проникающей хроматографией

А чем принципиальная разница?
Farma
Пользователь
Ранг: 382


19.09.2011 // 19:47:58     

Entomo пишет:

Нет-нет, я ни в коем случае не отрекаюсь от ОФ. Колонка С18 с 0,1% ТФУ - это наш основной помощник в разделении образцов. Ну, та же ионная пара по сути получается, ведь так?

Просто, помимо гидрофобности хочется еще по какому-нибудь признаку поделить. Выбрали размер. Хотелось бы фракции, полученные ОФ ВЭЖХ, прогнать через гельфильтрационную колонку.

Так что жду комментариев.



Так для комментариев маловато информации. Биосеп теоретически подойдёт (та, у которой диапазон эксклюзии 1-300 кДа), но повторю вопрос, на который Вы не ответили: насколько различаются размеры молекул пептидов в смеси? Если они все по 1 кДа, то не получится.

В качестве других механизмов для разделения Вам уже подсказали электростатическое взаимодействие. Да можно что угодно, хоть HILIC использовать. ИМХО шансов больше, чем при GFC без четкого понимания о составе смеси.
Entomo
Пользователь
Ранг: 9


20.09.2011 // 12:20:21     
Редактировано 1 раз(а)

2 AA_Alex: За ссылку спасибо, будем смотреть-сравнивать. Да, мы выделяем пептиды из гемолимфы насекомых и из культуральной жидкости тканей насекомых. Из лизата клеток - в ближайших планах.

2 абр: Насколько я понял, по принципу разделения гель-фильтрационная и гель-проникающая хроматография не различаются. Сито - и есть сито. Различаются они только по целям разделения. Гель-проникающая хроматография служит для очистки крупных молекул от мелкого мусора. Поэтому поры в ГП колонках имеют сравнительно большой размер и для разделения мелочи действительно не подходят. Гель-фильтрация же используется для разделения всяких-разных молекул: в зависимости от выбранной ГФ колонки, мы можем разделить и сравнительно мелкие молекулы, все завист от размера пор - в ГФ колонке они могут быть очень маленькими. То есть у ГФ задачи шире просто.

2 Farma: Сразу отмечу, что в большинстве случаев мы не знаем размера интересующего нас пептида, когда выделяем его из смеси. Его наличие в какой-либо из фракций мы определеяем по реакции культуры клеток на добавление этой фракции. При этом, разница в молекулярных массах белков гемолимфы могут отличаться В СОТНИ РАЗ. Так что вроде как, этот, относительно грубый, метод годится для наших экспериментальных задач.
Да, преимущественно, мы имеем дело с мелкими молекулами, но, наверное, основное, чего мы хотим добиться от ГФ - это не разделение мелочи, а ОТДЕЛЕНИЕ мелочи от крупных ненужностей. А уж разделение мелочи - как пойдет.. Посмотрим.

Одно из направлений нашей работы - это выделение антибиотиков из гемолимфы насекомых. Тут, возможно, катионообменная хромаография нам и подошла бы, поскольку эти антибиотики являются катионными пептидами. С катионной хроматографией я пока не разбирался, но ведь, насколько мне известно, уравновешивание неполярной колонки ТФУ для последующего смыва градиентом ацетонитрила является разновидностью динамической модификации сорбента. И по сути, превращает неполярный сорбент в полярный. То есть, электростатику получаем. Или я не прав?
Даст ли приобретение катионообменной колонки дополнительные преимущества в таком случае?

По поводу HILIC ничего сказать не могу. Там же ведь тот же принцип, что и в ОФ, только не растворителем вымываем из воды, а водой из растворителя. Тоже по степени гидрофобности делит, получается.

Или я ошибаюсь и оба эти метода (катионообменная хроматография и нормально-фазовая хроматография) помогут в дальнейшем разделении фракций, полученных ОФ ВЭЖХ? Поскольку основная наша задача сейчас - найти метод, ДОПОЛНЯЮЩИЙ ОФ.

Всем спасибо за ответы.
AA_Alex
Пользователь
Ранг: 343


20.09.2011 // 14:43:04     
Редактировано 2 раз(а)


Entomo пишет:

2 Farma: Сразу отмечу, что в большинстве случаев мы не знаем размера интересующего нас пептида, когда выделяем его из смеси.
Да, преимущественно, мы имеем дело с мелкими молекулами, но, наверное, основное, чего мы хотим добиться от ГФ - это не разделение мелочи, а ОТДЕЛЕНИЕ мелочи от крупных ненужностей.

Тогда подумайте - может Вам проще и дешевле будет что-нибудь типа Миллипоровских Амиконов - есть на 3 и 10 КД, у других производителей видел на 5 КД. При этом у Вас образец не будет разбавляться как при фракционировании на колонке.
www.millipore.com/catalogue/module/c84684
Farma
Пользователь
Ранг: 382


20.09.2011 // 14:55:30     

Entomo пишет:
2 Farma: основное, чего мы хотим добиться от ГФ - это не разделение мелочи, а ОТДЕЛЕНИЕ мелочи от крупных ненужностей. А уж разделение мелочи - как пойдет.. Посмотрим.

Для этих целей я бы рекомендовал ТФЭ с RAM сорбентом. Мы такой штукой неоднократно баловались и ИМХО в случаях когда нужно отделиться от высокомолекулярщины равных этому методу нет. Тем более, что есть in-line версия (встраиваемая в ВЭЖХ систему).

Еще как вариант можно использовать ионообменную или сайзэксклюзионную хроматографию среднего или низкого давления. Вариантов масса, в том числе есть небольшие картриджи, встраиваемые в ВЭЖХ систему. Для количественного выделения очень хорошая вещь.

Оба метода по цене вопроса будут ЗНАЧИТЕЛЬНО дешевле Биосепа.

  Ответов в этой теме: 16
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты