| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Выбор колонки для гель-фильтрации >>>
|
 |
| Автор | Тема: Выбор колонки для гель-фильтрации | |||||
|
Entomo Пользователь Ранг: 9 |
 16.09.2011 // 22:13:26
Уважаемые форумчане, История такая. Появилась возможность купить колонку для гель-фильтрации. Но с выбором ее самим не определиться. Работаем, главным образом, с пептидами, причем, чаще всего их молекулярная масса оказывается менее 10 кДа. Можно ли с помощью данного метода разделить такие мелкие молекулы? Буду благодарен, если посоветуете конкретную колонку, оптимальную для этих целей, с конкретными параметрами и указанием производителя. Изначально планировали делить пептидные соединения по какому-либо признаку, отличному от степени гидрофобности, как мы это делаем на ВЭЖХ колонке С-18. Решили выбрать в качестве этого признака размер пептида. Оптимален ли вообще выбор гель-фильтрации в этом случае? Может, появились какие-то более чувствительные методы фракционирования по размеру частиц? Сразу же скажу, что в ряде случаев работаем с неизвестными пептидами, то есть не знаем их свойств, кроме относительной молекулярной массы (определяем ультрафильтрацией) и степени гидрофобности (определяем твердофазной экстракцией). Местонахождение в какой-либо из фракций определяем по реакции на нее клеточной культуры и бактерий в антимикробном тесте. Если это существенное дополнение, то хроматограф наш - марки "SHIMADZU") Спасибо. |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
Farma Пользователь Ранг: 382 |
19.09.2011 // 15:42:59
ИМХО не нужна Вам гель-фильтрация, а нужна нормальная С18 колонка, возможно широкопористая. Для гельфильтрации значение будет иметь не только размер молекулы, но и разница в размерах отдельных компонентов смеси. Если она несущественная, то намучаетесь. Если не секрет, чем ОФ не устраивает? |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
19.09.2011 // 16:09:31
Либо ионообменная колонка. Можно воспользоваться анионообменником типа АХ. Либо С 18 с ПФ имеющей в составе ТФУ 0,1 %, потому как нормальная гель-фильтрация начинается от 1000 кДа, а такие массы как 10 кДа - нонсенс для ГПХ, равзве что капиллярный |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
19.09.2011 // 16:09:58
Либо ионообменная колонка. Можно воспользоваться анионообменником типа АХ. Либо С 18 с ПФ имеющей в составе ТФУ 0,1 %, потому как нормальная гель-фильтрация начинается от 1000 кДа, а такие массы как 10 кДа - нонсенс для ГПХ, равзве что капиллярный электрофорез. |
|||||
|
Entomo Пользователь Ранг: 9 |
19.09.2011 // 18:04:31
Нет-нет, я ни в коем случае не отрекаюсь от ОФ. Колонка С18 с 0,1% ТФУ - это наш основной помощник в разделении образцов. Ну, та же ионная пара по сути получается, ведь так? Просто, помимо гидрофобности хочется еще по какому-нибудь признаку поделить. Выбрали размер. Хотелось бы фракции, полученные ОФ ВЭЖХ, прогнать через гельфильтрационную колонку. По размеру, начиная от 100 кДа? Наверное, Вы путаете гельфильтрацию с гель-проникающей хроматографией (ну, судя по той литературе, которую я успел на выходных проштудировать). В настоящее время колонки для разделения мелочи есть. В итоге остановились на BioSep SEC-S 2000 фирмы Phenomenex. Не знаю, оправдан ли выбор.. Но подобные аналоги существуют и у других фирм. Еще будет возможность изменить свой выбор, если он не очень удачен. Так что жду комментариев. Всем спасибо за советы. |
|||||
|
AA_Alex Пользователь Ранг: 372 |
19.09.2011 // 18:31:16
Слышал хорошие отзывы о Вотерсовских колонках для ГПХ. У них есть и для "мелких" молекул (100-5КД и 100-10КД): Сам на таких не работал. А Вы пептиды, случайно, не из гемолимфы насекомых выделяете (судя по нику Entomo)? |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
абр Пользователь Ранг: 904 |
19.09.2011 // 19:33:17
А чем принципиальная разница? |
|||||
|
Farma Пользователь Ранг: 382 |
19.09.2011 // 19:47:58
Так для комментариев маловато информации. Биосеп теоретически подойдёт (та, у которой диапазон эксклюзии 1-300 кДа), но повторю вопрос, на который Вы не ответили: насколько различаются размеры молекул пептидов в смеси? Если они все по 1 кДа, то не получится. В качестве других механизмов для разделения Вам уже подсказали электростатическое взаимодействие. Да можно что угодно, хоть HILIC использовать. ИМХО шансов больше, чем при GFC без четкого понимания о составе смеси. |
|||||
|
Entomo Пользователь Ранг: 9 |
20.09.2011 // 12:20:21
Редактировано 1 раз(а) 2 AA_Alex: За ссылку спасибо, будем смотреть-сравнивать. Да, мы выделяем пептиды из гемолимфы насекомых и из культуральной жидкости тканей насекомых. Из лизата клеток - в ближайших планах. 2 абр: Насколько я понял, по принципу разделения гель-фильтрационная и гель-проникающая хроматография не различаются. Сито - и есть сито. Различаются они только по целям разделения. Гель-проникающая хроматография служит для очистки крупных молекул от мелкого мусора. Поэтому поры в ГП колонках имеют сравнительно большой размер и для разделения мелочи действительно не подходят. Гель-фильтрация же используется для разделения всяких-разных молекул: в зависимости от выбранной ГФ колонки, мы можем разделить и сравнительно мелкие молекулы, все завист от размера пор - в ГФ колонке они могут быть очень маленькими. То есть у ГФ задачи шире просто. 2 Farma: Сразу отмечу, что в большинстве случаев мы не знаем размера интересующего нас пептида, когда выделяем его из смеси. Его наличие в какой-либо из фракций мы определеяем по реакции культуры клеток на добавление этой фракции. При этом, разница в молекулярных массах белков гемолимфы могут отличаться В СОТНИ РАЗ. Так что вроде как, этот, относительно грубый, метод годится для наших экспериментальных задач. Да, преимущественно, мы имеем дело с мелкими молекулами, но, наверное, основное, чего мы хотим добиться от ГФ - это не разделение мелочи, а ОТДЕЛЕНИЕ мелочи от крупных ненужностей. А уж разделение мелочи - как пойдет.. Посмотрим. Одно из направлений нашей работы - это выделение антибиотиков из гемолимфы насекомых. Тут, возможно, катионообменная хромаография нам и подошла бы, поскольку эти антибиотики являются катионными пептидами. С катионной хроматографией я пока не разбирался, но ведь, насколько мне известно, уравновешивание неполярной колонки ТФУ для последующего смыва градиентом ацетонитрила является разновидностью динамической модификации сорбента. И по сути, превращает неполярный сорбент в полярный. То есть, электростатику получаем. Или я не прав? Даст ли приобретение катионообменной колонки дополнительные преимущества в таком случае? По поводу HILIC ничего сказать не могу. Там же ведь тот же принцип, что и в ОФ, только не растворителем вымываем из воды, а водой из растворителя. Тоже по степени гидрофобности делит, получается. Или я ошибаюсь и оба эти метода (катионообменная хроматография и нормально-фазовая хроматография) помогут в дальнейшем разделении фракций, полученных ОФ ВЭЖХ? Поскольку основная наша задача сейчас - найти метод, ДОПОЛНЯЮЩИЙ ОФ. Всем спасибо за ответы. |
|||||
|
AA_Alex Пользователь Ранг: 372 |
20.09.2011 // 14:43:04
Редактировано 2 раз(а) Тогда подумайте - может Вам проще и дешевле будет что-нибудь типа Миллипоровских Амиконов - есть на 3 и 10 КД, у других производителей видел на 5 КД. При этом у Вас образец не будет разбавляться как при фракционировании на колонке. |
|||||
|
Farma Пользователь Ранг: 382 |
20.09.2011 // 14:55:30
Для этих целей я бы рекомендовал ТФЭ с RAM сорбентом. Мы такой штукой неоднократно баловались и ИМХО в случаях когда нужно отделиться от высокомолекулярщины равных этому методу нет. Тем более, что есть in-line версия (встраиваемая в ВЭЖХ систему). Еще как вариант можно использовать ионообменную или сайзэксклюзионную хроматографию среднего или низкого давления. Вариантов масса, в том числе есть небольшие картриджи, встраиваемые в ВЭЖХ систему. Для количественного выделения очень хорошая вещь. Оба метода по цене вопроса будут ЗНАЧИТЕЛЬНО дешевле Биосепа. |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
