Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Калибровка для LC-MS >>>

  Ответов в этой теме: 7

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Калибровка для LC-MS
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

13.11.2010 // 0:47:35     
Редактировано 2 раз(а)

Коллеги,

подскажите пожалуйста как правильно строить калибровку в такой задаче.

Мы определяем некий компонент А в животном экстракте. У нас есть стандарт этого А, но не изотопно-меченный. Дериватизации не проводим: перед экстракцией в образец добавляем некий компонент Б в качестве внутреннего стандарта, весьма похожий на А и экстрагирующийся с одинаковой эффективностью. Эктракт колем в LC-MS, пики А и Б видим на разных MRM, выходят они близко друг к другу. Пока все просто.

Чтобы прокалиброваться, добавляли известное количество А с постоянным количеством Б в образцы, экстрагировали и анализировали.

Далее две проблемы: во-первых, в образцах уже есть А (но Б нет) Для того чтобы выйти с калибровкой к реальным количествам А, образцы делили, одну половину анализировали непосредственно (получая эндогенный А), во вторую добавляли известное кол-во А, а потом из площади пика вычитали эндогенный А. Получалось разумно, но как и ожидалось, менее точно. Естественно, там где А >> эндо-А, все красиво и линейно. Там где А близко к эндо-А, или А < эндо А, калибровку "шатает" (да, и само содержание эндо-А колеблется от образца к образцу)

Получить образец совсем без А невозможно, об'ект просто дохнет.

Далее аппетит партнеров с которыми мы работаем разыгрывается и они просят пойти еще ниже по содержанию А, обещая вывести редкие об'екты где А будет совсем мало. Образцы будут реально редкими, т.е. прокалиброваться стандартной добавкой будет невозможно.

Теперь вопрос: очень соблазнительно взять часть калибровки где А >> эндо-А, где все красиво и линейно и тупо провести ее в 0 (она туда идет непринужденно) Мы ведь знаем, что проблемы зоны А < эндо-А как раз из-за двух независимых анализов и вычитанием площадей не очень то ровных пиков.

Или мы должны честно использовать калибровку как она есть, вплоть до А << эндо-А, несмотря на то что ее начинает "шатать". В калибровке мы дошли до 25% эндо-А, но нужно бы ниже, так навскидку 5% эндо-А.

Еще раз для точности: эндо-А здесь содержание А в каких то "легко" доступных образцах, скажем животных "дикого типа". В мутантах, которых тяжело добыть, содержание А будет сильно меньше чем в доступных образцах (но по смыслу это тоже будет эндогенный А, конечно же).

Наверняка задача общая: подскажите, пожалуйста, как это делать по-уму или порекомендуйте что бы можно почитать?

Все происходит в академической лаборатории, то есть требования к метрологии у нас, скажем так, сниженные - в пределах здравого смысла. Этот А в мире все равно толком не меряют, а имунные методы показывают что-то за гранью добра и зла, так что любую более менее разумную цифирь от нас встречают с энтузиазмом.

Спасибо зараннее!

Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


13.11.2010 // 1:32:42     
Редактировано 2 раз(а)

У нас все жестко регламентировано, но с подобной ситуацией сталкиваться приходилось неоднократно: эндогенные стероидные гормоны, витамин Д и его метаболиты, кое-что из катехоламинов...

Задача распадается на две части - собственно градуировочная кривая (Standards) и проверочные образцы (QC samples).

Если аутентичной матрицы, свободной от анализируемого вещества, в природе не бывает, то для градуировочных стандартов подходит суррогатная матрица. Но потребуется обеспечить отсутствие матричного эффекта в методе. Суррогатной матрицей может служить: настоящая матрица, обработанная активированным углем или пропущенная через патрон С18; раствор альбумина в фосфатном буфере (для сыворотки), на худой конец просто буфер или вода. Главное, чтобы не содержала анализируемого вещества. Но лучше, чтобы содержала все остальное.

Кстати, большинство поставщиков плазмы и сыворотки поставляют также эти матрицы и пропущенными через активированный уголь (правда, не всегда это спасает!).

Проверочные образцы (QC samples), по требованиям FDA, могут быть приготовлены только на аутентичной матрице путем добавления анализируемого вещества (Spiking).

В этом случае необходим предварительный скрининг различных лотов чистых матриц, с целью выявления лотов с наименьшей концентрацией анализируемого вещества. В процессе валидации выбранный лот (или пул лотов) анализируется шестикратно (по градуировочной кривой) и берется средний результат, который использутся в качестве поправки при добавлении анализируемого вещества для создания серии образцов с требуемыми концентрациями.

Если Вы не связаны тербованиями GLP и различными Guidances, то Вы вообще можете обойтись без QC samples, а использовать только градуировочные образцы на суррогатной матрице. Только убедитесь сперва, что нет матричного эффекта! Именно поэтому, чем ближе суррогатная матрица к настоящей, тем лучше. Второй вопрос - стабильность градуировочных образцов, но он второстепенный, в конце концов, их можно и не хранить, а готовить свежими.
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


13.11.2010 // 10:05:04     
Спасибо, Islander!

Активированый уголь, пожалуй, не подойдет: если эта процедура уберет, скажем, 90% липидов, то экстракция А из такого компота пойдет сильно лучше по сравнению с обычными образцами. По сути, водичка останется, там и экстрагировать то будет не надо, коли и все.

А вот посмотреть на альтернативных животин, у которых А нету, это мысль. Можно человеческих жир взять, к примеру (адипоциты). Их с косметических операций идет много. Или червей. Надо подумать.

А вообще, интерполяция калибровки из "хороших" диапазонов в 0 есть операция метрологически незаконная, или как бы сойдет если мы честно напишем как делали? Разница так навскидку 25% будет, для биологов вообше смешная цифра.
virtu
VIP Member
Ранг: 2115


13.11.2010 // 16:06:27     
1. Согласен, предварительная очистка матрица от А - не вариант (в данной ситуации).
2. Остальные варианты - катят, но относительно не очень надежны, точнее их надежность увеличивается с приближением к "нативной" матрице.
3. Здесь еще многое зависит от диапазона опред. конц., LOQ, концентрации IS и т.д. Думаю, помогло бы использование двойного IS, ессно с различ. конц. Вы, кстати, используете weighted regression?
4. Насчет экстраполяции из "хорошей" области. Только не принудительно в ноль.
Можно сделать так: построить градуировку методом добавок на нативной матрице (гомогенной, т.е. конц. А = const), и обычную на суррогатной, сравнить полученные зависимости.
Более сложно, когда Вам нужно "опуститься" ниже той концентрации, которая есть уже в доступной матрице. Могут быть фокусы, и ошибка экстраполяции может быть значительна. Здесь, конечно, бы помог второй внутр. ст. с соотв. концентрацией.
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


13.11.2010 // 16:10:21     

Spectrometrist пишет:
А вообще, интерполяция калибровки из "хороших" диапазонов в 0 есть операция метрологически незаконная, или как бы сойдет если мы честно напишем как делали? Разница так навскидку 25% будет, для биологов вообше смешная цифра.
Ежели Вы никакими Guidance не повязаны, то можете смело вести градуировку принудительно через ноль, они только спасибо скажут. Ничего метрологически незаконного в этом нет. Нарушение линейности вблизи нуля обычно бывает связано либо с адсорбцией на чем-то при низких концентрациях, либо с нестабильностью (например, окислением). Если Вы уверены, что ничего такого нет, то и не стоит заморачиваться.
А аналогичная матрица из другого биологического вида может оказаться самым подходящим вариантом, если совесть мучает....
Islander
VIP Member
Ранг: 1065


13.11.2010 // 16:18:59     

virtu пишет:
Можно сделать так: построить градуировку методом добавок на нативной матрице (гомогенной, т.е. конц. А = const), и обычную на суррогатной, сравнить полученные зависимости.

Об этом я и писал, Standards на суррогате, QC samples на пуле из предварительно отобранных лотов подлинной матрицы. Общепринятый подход в "зарегулированной" биоаналитике.

Но если экстракция безупречна (степень извлечения не зависит от концентрации), вещество стабильно и не цепляется на посуду, то принудительная экстраполяция в ноль беды не сделает. Проверено.
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
Химмед Химмед
Официальный дистрибутор ведущих компаний, таких как Merck, Acros Organics, Calbiochem, Fluka, IKA, Labscan, Roth, Sigma-Aldrich. Supelco, ОАО "Химлаборприбор" и др.
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


13.11.2010 // 18:54:29     
Коллеги, спасибо за советы!

Подумаю, как быть. Для уточнения: я думаю то шатания калибровки в основном (да, реально, единственно) связаны с вычитанием пиков.

Качество экстракции проверяли, вытаскиваем где то 75% и выход не зависит от содержания А и от матрицы в каких то разумных диапазонах (брали экстракт из удвоенного, утроенного и т.д. количества образца, все то же самое)

Б - очень близкий аналог А и (как показано) одинаково экстрагируемый, но абсолютно отсутсвующий в образцах дает хорошую линейность вплоть до 5-10 % эндо А (если в молях), т.е. реально не теряется и не деградирует.

Рассуждая, почему А должен вести себя сильно иначе?

Попробуем пожить с линейной калибровкой из диапазона А> эндо -А и посмотрим что будет.

Кстати, интуиция подсказывает что в биологическом журнале скорее простят интерполированную линейность, чем суррогатную матрицу. Аргумент будет такой:

Рецензент: да вы с ума сошли, там же все другое?!
Мы: ну что там другое то? что? Липиды да белки...
Рецензент: там другое ВСЕ! Или вы тоже думаете что мышь это та же дрожжа, только волосатая?!

Счастливых выходных!

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


23.02.2011 // 15:23:20     
Возобновление старой полезной темы:

Мы кажется придумали как сделать суррогатную матрицу: потребовался мутант с реально низким содержанием А плюс дополнительная экстракция. В таком образце липидов тонны, а А нет совсем.

Теперь вопрос: мне наверное нужно показать что это такая суррогатная матрица адекватна нативной. Но, каков будет критерий адекватности? Сойдет ли, например, если калибровки в нативной и суррогатной матрице совпадут в диапазоне А >> А-нативное - потому что в районе А = А-нативное они точно не совпадут, по причинам обсуждавшимся выше.

Вообще то для академии это типа чистоплюйство, но раз уж мы нарыли (кстати, случайно) "кандидата в суррогат", то почему бы не сделать "классическую" методику для поколений грядущего


  Ответов в этой теме: 7

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты