Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Glycoforms of IFN b1a. LC ESI MS/MS. >>>

  Ответов в этой теме: 11
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Glycoforms of IFN b1a. LC ESI MS/MS.
virtu
VIP Member
Ранг: 2133

11.06.2010 // 14:33:42     
Редактировано 1 раз(а)

Идентифицировать. 5-10ррм в биологической среде (каждого аналита - 6 гликоформ основных, номинальные м. массы известны 20-23кДа).
"Игрался" с фармстандартом. ОФ-ВЭЖХ на Sil C18 (60мкл/мин, спрэй простой).
300-700нг на пик (из предположения, что в стандарте 6 гликоформ, хотя я в этом уже начинаю сомневаться) - в скане (+esi, 1200-2000 m/z) "ловил" пару пиков (s/n 4-8) - масс-спектр. разобрать невозможно, что и понятно.
Прямая инфузия после соотв. очистки стандарта - "не радует" глаза, да и перспектива инсульта при деконволюции мс-спектра не радует.

В общем, не хватает "чутья".

Вопросы:
1. Имеет ли смысл пробовать "ловить" в форме аддуктов?
2. MRM переходы и их условия, где можно посмотреть (копался, но может не там ищу?)?
3. Может, есть какие-либо "хитрости" при работе с гликозилированными белками?

С другими белками работал, но с концентрациями была другая ситуация, да и задачи другие.

Спасибо всем откликнувшимся!
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


11.06.2010 // 17:31:12     
Если бы вы более четко обозначили что вы хотите увидеть, было бы проще что то дельное подсказать. Я не думаю что здесь настолько много людей в IFN бизнесе что могут понять проблему с полуслова.

В биол. препарате я бы (ИМХО) вообще не шел за интактными массами белков, но это может от незнания. Хотя, на недавней ASMS в Salt Lake City был толковый постер от Thermo где они показывали как надо оптимизировать MRM на интактных небольших белках, помоему там был трюк в том что надо идти за малыми collision energy и ловить transitions из многозарядных в многозарядные ионы. Поищите у них на сайте, мoжет уже постеры выложены в pdf. Если нет, дайте знать, я попробую отыскать, где то по моему CD с постерами уже ходили, или напишите сами локальным Thermo людям, у них должны уже быть
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


12.06.2010 // 16:16:34     
Редактировано 1 раз(а)

Дубль два.
Задача: Идентифицировать 6 известных гликоформ ИФН с известной м.м. (20-23кДа) в биол. среде, ожидаемый диапазон концентраций 5-10ppm.
План был такой:
Standard. Scan (1000-2000m/z), Parent scan (1000-2000m/z>163, 204, 366 m/z)/SIR (163, 204, 366 m/z with fragmentation in ion source), Daughter scan (product ion scan) then creation of MRM method (я не собирался идти за интактными массами).

Из предыдущего поста понятно, что дело остановилось на стадии Scan (1000-2000m/z). К остальным стадиям даже не ходил. Сразу скажу, что SIR по предикт ионам я не делал, т.к. считаю, что это "шило на мыло".
При заколе (ожидаемая масса аналита в пике приведена выше) что-то детектируется (УФ 260-280нм - МС), но я не могу разобрать какие ионы дают вклад в TIC. Я сейчас прорабатываю версию "кривого" стандарта (новый, но интуиция мне подсказывает, что внутри может быть не то, что мне нужно, т.к. покупал и т.д. не я, а "заказчик").
Люди советовали попробовать в -ESI в виде аддуктов с формиат ионами (интуитивно, мне этот подход не приглянулся и я не пробовал). Соотв. понятны мои 1 и 3 вопросы (как увеличить эффективность ионизации или сигнал/шум), вопрос про MRM тоже.

Можно пойти через SIR (детектирование "осколков" + время удерживания относ. стандарта), чувствительность выше чем MRM (по личному опыту по другим гликоз. белкам и инфе), но смущает более низкая специфичность (относ. MRM), я, правда, применяю одну хитрость, чтобы увеличить специфичность, но до уровня MRM все равно не тянет.

Спасибо за вектор! Посмотрю.
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


14.06.2010 // 14:22:40     
Редактировано 1 раз(а)

T.e. идея в том что дайджеста не делать и мод. пептиды не искать, а в LC/MS делать precursor scan на сахарные остатки из интактных белков, а потом считать интактные массы (белков) деконволюцией многозарядных ионов. Я правильно вас понял?

Пусть коллеги поправят, но я бы так не делал, особенно in in vivo образцах. И особенно на трипл кваде, где чтобы быстро сканировать приходится ионную статистику просто потерять, но ведь еще и разрешения у машины совсем нет. Да еще белковые пики будут хвостить на LC, да еще аддукты на белках куда сильнее, чем на пептидах, ну и по мелочи типа окисленного метионина / -нов, да пара амидов дезамидировалась и т.д. - ну там еще много чего что никак не контролируется.

Может лучше сделать дайджест (с трипсином? / LysC), посчитать ожидаемые пептиды, взять 2+/3+ зарядные прекерсоры (может, плюс еще одну форму с потерей воды?) и делaть MRM? Для контоля, можно поставить MRM на фрагмент m/z 86 задрав collision energy, по крайней мере будет реальный пик и будете уверены что это пептид, а не бэкграунд.
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


15.06.2010 // 12:05:08     
Редактировано 1 раз(а)


Spectrometrist пишет:
T.e. идея в том что дайджеста не делать и мод. пептиды не искать, а в LC/MS делать precursor scan на сахарные остатки из интактных белков, а потом считать интактные массы (белков) деконволюцией многозарядных ионов. Я правильно вас понял?

Да, отчасти. Это был один из вариантов, который я хотел попробовать для данной ситуации (на пути к MRM), но конечная цель - MRM.
Кстати, просмотрел программу ASMS 2010, и не нашел там постера (это точно постер был?) от Thermo с указанной тематикой (раздел, случайно не помните?).


Spectrometrist пишет:
Пусть коллеги поправят, но я бы так не делал, особенно in in vivo образцах. И особенно на трипл кваде, где чтобы быстро сканировать приходится ионную статистику просто потерять, но ведь еще и разрешения у машины совсем нет. Да еще белковые пики будут хвостить на LC, да еще аддукты на белках куда сильнее, чем на пептидах, ну и по мелочи типа окисленного метионина / -нов, да пара амидов дезамидировалась и т.д. - ну там еще много чего что никак не контролируется.

C Вами согласен, что precursor scan не "фонтан" для данной ситуации.
Если все правильно делать, то пики белков (конечно, мы понимаем, что многое еще зависит от белка) хвостить не будут.
Да, аддукты сильнее.


Spectrometrist пишет:
Может лучше сделать дайджест (с трипсином? / LysC), посчитать ожидаемые пептиды, взять 2+/3+ зарядные прекерсоры (может, плюс еще одну форму с потерей воды?) и делaть MRM? Для контоля, можно поставить MRM на фрагмент m/z 86 задрав collision energy, по крайней мере будет реальный пик и будете уверены что это пептид, а не бэкграунд.

Это я оставил на последок. Я знаю, что в основном делают так, хотя, в данной ситуации - это целая история. Просто, я решил попасть из пункта А в пункт В, минуя пункт С.
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


15.06.2010 // 12:53:23     
Сейчас статью выпихиваю, так что "хватай мешки вокзал отходит". Дайте мне день, мах 2 я этот постер раскопаю.

Кстати, можeт коллеги из Thermo читают этот форум и могут помочь быстрее? Это точно постер, точно из Thermo откуда то из US,был вывешен Tue or Wed.

Ни в коей мере не хочу вас отговаривать, но идея с интактными массами реально трудная - на рекомбинантных белках (особенно из компаний!) я видел много вариаций сиквенса и, соотв. интактной массы. Я имею ввиду что сиквенс из датабазы не в точности соответсвует сиквенсу белкового препарата: чтобы реальный сиквенс получить через патенты и т.д. нужно адское терпение иметь, плюс окисление метионинов (и меньше, н тоже не ноль, триптофана), плюс дезамидирование (и на низком разрешении масса просто с'езжает вверх), и т.д.

Я бы начал со стандарта и пока я точно не увижу ясные массы в точности соответствующие ожидаемым, я в in vivo не полезу никогда. Там будет только хуже.

Кстати, обычная ситуация в сервисе для кристаллографов. Приходят, сияющие - "отличные рентген, структура собралась ОК, пишем в Nature, массу вот подтвердите - кристалл вот он, количества для масс спека немерянные". Опс - а масса то вообще не та. Оказывается (регулярно!) плазмиду то никто и не секвенировал... чего возиться, надо мг грести и кристаллы лепить...
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
БИОМЕР, НПП БИОМЕР, НПП
Разработка, производство и продажа анализаторов для пищевой промышленности. Ультразвуковые анализаторы для анализа молока, пива, вина, ликероводочных изделий. Оборудование для потенциометрии – модельный ряд рН-метров и иономеров. Комплексное оснащение лабораторий. На базе выпускаемого оборудования разработка методик выполнения измерений для конкретных прикладных задач.
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


15.06.2010 // 17:07:06     
Редактировано 2 раз(а)


Spectrometrist пишет:
Сейчас статью выпихиваю, так что "хватай мешки вокзал отходит". Дайте мне день, мах 2 я этот постер раскопаю.

Буду благодарен. Сам, вроде, все прокопал. Да и по сети смотрел, работы есть, конечно, но не от thermo.


Spectrometrist пишет:
Я имею ввиду что сиквенс из датабазы не в точности соответсвует сиквенсу белкового препарата: чтобы реальный сиквенс получить через патенты и т.д.

Это как? Белок есть белок, если последовательность другая, то это... Или Вы имеете ввиду разницу условий - это ессно.


Spectrometrist пишет:
Я бы начал со стандарта и пока я точно не увижу ясные массы в точности соответствующие ожидаемым, я в in vivo не полезу никогда. Там будет только хуже.
Я то же начал со стандарта.


Spectrometrist пишет:
Кстати, обычная ситуация в сервисе для кристаллографов. Приходят, сияющие - "отличные рентген, структура собралась ОК, пишем в Nature, массу вот подтвердите - кристалл вот он, количества для масс спека немерянные". Опс - а масса то вообще не та. Оказывается (регулярно!) плазмиду то никто и не секвенировал... чего возиться, надо мг грести и кристаллы лепить...

Да, остается только
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


15.06.2010 // 18:01:15     

virtu пишет:


Это как? Белок есть белок, если последовательность другая, то это... Или Вы имеете ввиду разницу условий - это ессно.


Если это препарат, то сиквенс не обязательно совпадате с нативным белком (так как это в датабазе). Это может быть укороченный вариант, или вариант где несколько ак заменены - для технологичности или устойчивости, большего биол эффекта, чтобы обойти патент или вообще по неизвестным соображениям. Т.е сиквенс должен быть точно известен (изготовителям), где то отражен в документах / патентах, но не обязательно идентичен wild type. Какой же там реально сиквенс часто тяжело докопаться. Поэтому обязательно надо начать с точной массы, чтобы понимать с чем конкретно вы имеете дело
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


15.06.2010 // 19:04:23     
Да... Не знал. Спасибо. Полезная инфа.
Но к моей ситуации это не имеет отношения.
Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


16.06.2010 // 1:08:08     
Коллекция pdf представленных Thermo на ASMS в Salt Lake City здесь:

thermoscientific.com/wps/portal/ts/news/detail?contentId=51196

download свободный.

Я имел в виду постер by Gvozdyak et al. "Srm Analysis Of Intact Biopolymers On Triple Quadrupole Instruments"

Удачи!
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


16.06.2010 // 13:37:02     
Спасибо!

В общем, я так и собирался делать, и остановился на пункте 1 (full scan Q1) и задавал соотв. вопросы. Спасибо.
Значит будем пробовать через предикт.

З.Ы.: Thermo, MRM, proteins - поэтому ничего не нашел.

  Ответов в этой теме: 11
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты