| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Биомедицинская масс-спектрометрия MALDI >>>
|
 |
| Автор | Тема: Биомедицинская масс-спектрометрия MALDI |
|
Shreyner Пользователь Ранг: 3 |
 07.03.2011 // 10:20:39
Добрый день!у меня такой вопрос: для своей дипломной работы я исследую сайты ацетилирования белков крови человека и крысы (альбумин и гемоглобин) при их взаимодействии с ацетилсалициловой кислотой методами масс-спектрометрии. На данный момент мной проведена модификация этих белков и сняты масс-спектры (MALDI), найдены модифицированные пики (т.е. сранивала модифицированный и немодифицированный белок на появление новых пиков с разницей 42.01 Да), но чтобы доказать, что модификация прошла и это именно АСК нужно провести MS-MS анализ, но найденные пики малы по интенсивности и поднять их для тандемной масс-спетрометрии очень сложно. Может вы что-нибудь посоветуете, чтобы эти интенсивности повысить? Для модификации мной были взяты различные концентрациИ АСК от 0.01-4 mM, после модификации проводился ферметативный гидролиз (трипсин), а дальше триптические гидролизаты я элюировала градиентом ацетонитрила с колонки С18. Спасибо! |
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
07.03.2011 // 19:22:25
Вы собирали фракции с С18 колонки и потом делали MALDI или делали LC-MALDI? МС/МС - вы имеете ввиду MALDI MS/MS? На какой машине, TOF/TOF или Bruker с LIFT? Сколько белка вы дериватизировали и сколько пар пептидов-кандидатов вам надо проверять? Не зная деталей эксперимента трудно что то посоветовать. |
|
Shreyner Пользователь Ранг: 3 |
07.03.2011 // 20:47:03
Делали MALDI, да, имею в виду тандемную масс-спектрометрию, машина TOF/TOF, количество белка 100 мкл (С=1 мг/мл), пар пептидов порядка 10 |
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
08.03.2011 // 20:14:53
Редактировано 1 раз(а) Уточните пожалуйста, вы делали хроматографию на С18, собирали фракции, а потом разбавленную аликвоту из каждой фракции добавляли на MALDI target и анализировали? Или (как в LC MALDI) весь элюат с колонки раскапывался на MALDI targets без разбавления? Если так, то нагрузки совершенно дикие, при таких пики-артефакты не редкость. Может, разбавить аликвоты в 10-50 раз и перестрелять? Спектры будут почище и интерпретация будет увереннее. У меня немного опыта работы с TOF/TOF, но сразу было понятно машина сложная. Вы проверяли precursor gating нормально работает? Типа, взять просто дайджест или даже пару-тройку пептидов, нагрузить так фемтомоль 100 и посмотреть как пройдет МС/МС. Будут ли пики уверенно соответствовать ожидаемым фрагментам, или только потеря воды от precursor и шум в легких массах? Будет ли изолированый precursor иметь ожидаемое изотопное распределение? Заставить пептиды лучше лететь нельзя (кстати, пептиды с ацетилами должны лететь хуже чем интактные). В успех дополнительной дериватизации смеси чем-то протон-акцепторным мне не верится. К тому же, количества у вас гигантские, даже если степень дериватизации 1% то вряд ли вы лимитированы чутьем и вам надо за него бороться. Если все хорошо работает, то и с 10 фемтомолей вы должны видеть вполне вменяемые спектры. Ну и дежурный совет, поменять матрицу.... но это вы и без советов знаете |
|
Shreyner Пользователь Ранг: 3 |
08.03.2011 // 21:34:27
100 мкл белка - это объем модификации. а на колонку наносила по 5 мкл. на мишень наносилось вообще 1.5 большое спасибо за Ваши советы! |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 4 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
